Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở

CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides

Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI

VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản

Mã ngành : 62 62 03 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. NGUYỄN HỮU DŨNG

2. GS.TS. HEIDRUN I. WERGELAND

KHÁNH HÒA - 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

NGUYỄN THỊ THANH THÙY

NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở

CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides

Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI

VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

KHÁNH HÒA - 2014

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở

cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi trong suốt

thời gian từ năm 2007-2012 dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của Thầy Cô hƣớng dẫn.

Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc

ai công bố trong bất kỳ công trình nào.

Khánh Hòa, năm 2014

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Thùy

ii

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học

Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện

thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi

trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mô hình hóa ven biển và quản lý sức khỏe cá￾NUFUPRO 2007/10086” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và hỗ trợ toàn

bộ kinh phí cho tôi thực hiện luận án.

Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi muốn dành riêng cho hai Thầy Cô

giáo hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Dũng và Giáo sƣ Heidrun I. Wergeland đã định

hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

luận án.

Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng

ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và

phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam đã cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng trong

nghiên cứu này.

Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS. Lê Văn Bé, TS. Phạm

Quốc Hùng, TS. Đặng Thúy Bình, ThS. Nguyễn Thị Thoa đã sẵn lòng giúp đỡ,

đóng góp ý kiến quý báu, chia sẻ kinh nghiệm và động viên tinh thần trong quá

trình thực hiện luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch

- Khoa sinh học - Trƣờng đại học Bergen: TS. Ragnhild A. Jakobsen, TS. Gyri T.

Haugland, TS. Eirin F. Pettersen, NCS Anita Ronneseth và KS. Paul H. Lovik đã

tận tình hƣớng dẫn các kỹ thuật phân tích các thông số miễn dịch trong thời gian tôi

thực hiện nghiên cứu tại Trƣờng Đại học Bergen, Nauy.

Cuối cùng, tự đáy lòng cho phép tôi đƣợc bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu

sắc nhất đến những ngƣời thân yêu của tôi: Má, anh chị, chồng tôi Nguyễn Văn

Hùng và con gái Nguyễn Anh Thi đã luôn bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho

tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn và tri ân tất cả tình cảm và sự giúp đỡ quý báu đó.

Khánh Hòa, năm 2014

Nguyễn Thị Thanh Thùy

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN..........................................................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................................................ii

MỤC LỤC.....................................................................................................................................................iii

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮVIẾT TẮT...........................................................................................vi

DANH MỤC BẢNG...............................................................................................................................viii

DANH MỤC HÌNH....................................................................................................................................ix

MỞ ĐẦU........................................................................................................................................................1

CHƢƠNG 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................................4

1.1. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides..........................4

1.1.1. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu .............................................................4

1.1.2. Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam..........................................6

1.1.3. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi.......................................................8

1.2. Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển...................10

1.2.1. Vi khuẩn Vibrio ........................................................................................10

1.2.2. Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển............................................15

1.3. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng ................................................................17

1.3.1. Miễn dịch tự nhiên ...................................................................................18

1.3.2. Miễn dịch đặc hiệu ...................................................................................23

1.3.3. Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch ở cá ......................................27

1.4. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá .............29

1.4.1. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi .................29

1.4.2. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi................................................30

1.5. Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam....................36

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................40

2.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................40

2.1.1. Đối tƣợng..................................................................................................40

2.1.2. Vật liệu .....................................................................................................40

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................41

2.1.4. Thời gian nghiên cứu................................................................................41

iv

2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án........................................42

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................42

2.3.1. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.................42

2.3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc

hiệu ở cá mú chấm cam.............................................................................................45

2.3.3. Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam ...............50

2.3.4. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus................................................................................52

2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..............................................................................56

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢNGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.................................................57

3.1. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam ..57

3.1.1. Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa.............57

3.1.2. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus....................................59

3.1.3. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với

cá mú chấm cam........................................................................................................67

3.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả

năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam................70

3.2.1. Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế bào máu của cá

mú chấm cam ............................................................................................................71

3.2.2. Ảnh hƣởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú

chấm cam...................................................................................................................74

3.2.3. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền

thận cá mú chấm cam................................................................................................77

3.2.4. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch

cầu tiền thận cá mú chấm cam ..................................................................................80

3.2.5. Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam............................................................83

3.3. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus.......................................................................................................86

3.3.1. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam..............................86

3.3.2. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA.......................................88

v

3.3.3. Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam

sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin

có bổ sung chất bổ trợ FIA ..........................................................................................89

CHƢƠNG 4:KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN..................................................................102

Kết luận................................................................................................................102

Đề xuất ý kiến......................................................................................................103

TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................................104

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có)

BA

BHI

CFU

CMI

CRP

DI

ĐƢMD

FCA

FIA

HGNNV

HI

HRP

i-ELISA

Ig

IgM

IL-1

kDa

LD50

LPS

MAC

MAM

MHC II

NB

NCC

NK

NTTS

Blood agar base

Brain Heart Infusion

Colony Forming Unit

Cell-Mediated Immunity

C-reaction protein

Direct Immersion

Freund’s complete Adjuvant

Freund’s Incomplete Adjuvant

Humpback grouper nervous necrosis

virus

Hyperosmotic Immersion

Horseradish peroxidase

indirect Enzyne Linked

Immunosorbent Assay

Immunoglobulin

Immunoglobulin M

Interleukin 1

Kilo Dalton

Lethal dose 50

Lipopolysacharides

Membrane attacking complex

Multivalent Adhesion Molecule

Major histocompatibility complex

Nutrient Broth

Non-specific cytotoxic cell

Natural killer cell

Môi trƣờng thạch máu

Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn

Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn

Miễn dịch qua trung gian tế bào

Protein phản ứng C

Ngâm trực tiếp

Đáp ứng miễn dịch

Chất bổ trợ toàn phần Freund

Chất bổ trợ bán phần Freund

Loại virus gây hoại tử thần kinh ở cá mú

lƣng gù

Ngâm trong dung dịch ƣu trƣơng

Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết

enzyme gián tiếp

globulin miễn dịch

globulin miễn dịch lớp M

Đơn vị tính khối lƣợng phân tử protein

Liều gây chết 50%

Phức hợp tấn công màng

Phân tử gắn kết đa trị

Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II

Môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng

Tế bào độc không đặc hiệu

Tế bào diệt tự nhiên

Nuôi trồng thủy sản

vii

OD

OMP

PA

PBS

RBA

RPS

RPP

SAP

SDS￾PAGE

sIg

TCBS

TDH

TLH

αTNF

TNGB

TSA

TSB

TRH

Vibriosis

VNN

VSV

Optical Density

Outer Membrane Protein

Phagocytosis activity

Phosphate Buffered Saline

Respiratory burst activity

Relative Percent Survival

Relative Percent Protection

Serum Amyloid Protein

Sodium Dodecyl Sulfate -

Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Surface immunoglobuline

Thiosulphate citrate bile salt agar

Thermostable direct haemolysin

Thermolabile haemolysin

alpha Tumor Necrosis Factor

Trypticase Soya Agar

Trypticase Soya Broth

tdh-related hemolysin

Viral Nervous Necrosis

Mật độ quang

Protein ngoại mạc

Hoạt tính thực bào

Dung dịch đệm muối photphat

Hoạt tính bùng nổ hô hấp

Hệ số sinh tồn tƣơng đối

Hệ số bảo vệ tƣơng đối

Protein huyết thanh dạng sợi

Điện di trên gel polyacrylamide có SDS

Phân tử globulin miễn dịch bề mặt

Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Vibrio

Độc tố gây dung huyết bền nhiệt

Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt

Yếu tố anpha gây hoại tử khối u

Tác nhân gây bệnh

Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tổng hợp

Môi trƣờng lỏng dinh dƣỡng tổng hợp

Độc tố gây dung huyết liên quan tdh

Bệnh do vi khuẩn Vibrio

Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút

Vi sinh vật

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi...................................................9

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus...60

Bảng 3.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides.......72

Bảng 3.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau

2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan ....................................................................................74

Bảng 3.4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam khi

đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau..................................77

Bảng 3.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất

hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides..........................................99

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides......................................................4

Hình 1.2: Xu hƣớng sản lƣợng và giá trị cá mú trên thế giới ....................................6

Hình 1.3: Sản lƣợng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu ...............7

Hình 1.4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio .......................................11

Hình 1.5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus ....................26

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu ........................................................................42

Hình 2.2: Hệ thống bể (a) và cá mú chấm cam thí nghiệm (b).................................46

Hình 2.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng phân lập bạch cầu .....................................48

Hình 2.4: Các bƣớc khảo sát hoạt tính thực bào ......................................................49

Hình 3.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa ..........57

Hình 3.2: Vibrio parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch máu...............................62

Hình 3.3: Kết quả điện di trên gel agarose gen 16s rDNA của các chủng vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus ..........................................................................................63

Hình 3.4: Cây phát sinh loài các chủng vi khuẩn Vibrio .........................................63

Hình 3.5: Thành phần protein của các chủng Vibrio parahaemolyticus...................66

Hình 3.6: Cá mú chấm cam Epinephelus coioidescảm nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ....68

Hình 3.7: Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá mú chấm cam Epinephelus coioides khi bị

cảm nhiễm bởi Vibrio parahaemolyticus với các chủng và mật độ vi khuẩn khác

nhau ..........................................................................................................................68

Hình 3.8: Hình ảnh các loại tế bào máu cá mú chấm cam Epinephelus coioides ....72

Hình 3.9: Chỉ số thực bào của bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam Epinephelus

coioides......................................................................................................................78

Hình 3.10: Hình ảnh thực bào của các tế bào bạch cầu mô thận cá mú chấm cam

Epinephelus coioides ................................................................................................79

Hình 3.11: Hoạt tính RB của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam

Epinephelus coioides.................................................................................................81

Hình 3.12: Tỷ lệ chết tích lũy của cá mú chấm cam Epinephelus coioides cảm

nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở ngày thứ nhất (a) và ngày thứ 15 (b) sau

khi ngừng cho ăn β-glucan..........................................................................................83

x

Hình 3.13: Kết quả phân tích phân tử globulin miễn dịch (IgM) của cá mú chấm

cam bằng các kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot ...............................................86

Hình 3.14: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch

bằng 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bị bất hoạt bằng formalin đƣợc xác

định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm ...................................................88

Hình 3.15: Biểu hiện liên kết giữa kháng thể của cá mú chấm cam Epinephelus

coioides với protein của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bằng kỹ thuật Western

Blot ...........................................................................................................................90

Hình 3.16: Biến động hiệu giá kháng thể ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides

sau khi gây miễn dịch bằng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 đã bất hoạt

bằng formalin đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA đo ở bƣớc sóng 490 nm .........93

Hình 3.17: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cƣờng

độc ở thời điểm 30 ngày sau khi gây miễn dịch .......................................................97

Hình 3.18: Tỷ lệ chết tích lũy ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides công cƣờng

độc ở thời điểm 60 ngày sau khi gây miễn dịch .......................................................98

1

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng phục vụ

nhu cầu dinh dƣỡng cho con ngƣời, đồng thời đem lại kim ngạch xuất khẩu cho

nhiều nƣớc có tiềm năng phát triển NTTS, trong đó có Việt Nam.

Hiện nay, xu hƣớng phát triển NTTS thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng

là nâng cao năng suất trên đơn vị diện tích ven bờ nhƣng đảm bảo sự phát triển bền

vững, thân thiện với môi trƣờng tự nhiên. Tuy nhiên, cùng với mức độ thâm canh

hóa, dịch bệnh là trở ngại chính cho sự phát triển bền vững sản lƣợng NTTS.

Trong những năm qua, việc chữa trị các bệnh do vi khuẩn và do một số tác

nhân khác bằng thuốc kháng sinh và hóa chất đã gây ra nhiều hậu quả tiêu cực, đã

không mang lại hiệu quả chữa trị nhƣ mong muốn mà còn làm tăng chi phí sản xuất.

Ngoài ra, việc lạm dụng kháng sinh trong điều trị dẫn đến phát sinh các chủng vi

khuẩn kháng thuốc, không đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm [19] và ảnh hƣởng

tới thị trƣờng xuất khẩu thủy sản của Việt Nam.

Trƣớc bối cảnh đó, nghiên cứu và phát triển vaccine phòng bệnh cho các đối

tƣợng nuôi thủy sản có giá trị kinh tế thực sự là một cuộc cách mạng trong phát

triển NTTS; đây là việc làm cấp thiết và phù hợp với mục tiêu phát triển NTTS ổn

định, bền vững và thân thiện với môi trƣờng. Để thực hiện định hƣớng này, các

nghiên cứu cơ bản về đặc điểm hệ miễn dịch của đối tƣợng nuôi là một trong những

bƣớc khởi đầu quan trọng cần tập trung ƣu tiên.

Trên thế giới, nghiên cứu miễn dịch ở cá bắt đầu từ những năm 50 của thế kỷ

thứ 18 và ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng miễn dịch học ở

cá [204]. Trong vài chục năm gần đây, nghiên cứu sản xuất và sử dụng vaccine

phòng bệnh cá đã đƣợc thực hiện ở nhiều nơi trên thế giới và gần 100 loài cá đã

đƣợc nghiên cứu về miễn dịch ở mức độ khác nhau [12].

Ở Việt Nam, nghiên cứu về miễn dịch ở cá vẫn còn khá mới mẻ và chúng ta

chỉ mới ở những bƣớc đi đầu tiên. Điều này thể hiện qua số lƣợng công trình nghiên

cứu liên quan đến miễn dịch và vaccine ở cá còn rất hạn chế. Chỉ một vài cơ quan

nghiên cứu trong cả nƣớc bắt đầu nghiên cứu cũng nhƣ hợp tác với các tổ chức