Nghiên cứu đa hình gen liên quan đến vô sinh ở nam giới thăm khám tại bệnh viện trường Đại học Y Hà Nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC QUY NHƠN

ĐOÀN THỊ HUYỀN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH GEN LIÊN QUAN ĐẾN

VÔ SINH Ở NAM GIỚI THĂM KHÁM TẠI

BỆNH VIỆN TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số: 8420114

Ngƣời hƣớng dẫn 1: TS. Nguyễn Thùy Dƣơng

(Người hướng dẫn thứ nhất)

Ngƣời hƣớng dẫn PGS TS Nguyễn Thị Mộng Điệp

(Người hướng dẫn thứ hai)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng

dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thùy Dương và PGS.TS. Nguyễn Thị Mộng

Điệp. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và

chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc

thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận

văn đã được chỉ rõ nguồn gốc rõ ràng và được phép công bố.

Bình Định, tháng 08 năm 2022

Học viên

ĐOÀN THỊ HUYỀN TRANG

ii

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy

hướng dẫn: TS. Nguyễn Thùy Dương (làm việc tại phòng Hệ gen học người,

viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và

PGS.TS Nguyễn Thị Mộng Điệp (làm việc tại trường Đại học Quy Nhơn) đã

trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, bạn bè tại Viện

Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nơi tôi

thực tập đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và

làm việc.

Luận văn này được hoàn thành dưới sự tài trợ từ đề tài khoa học "Xây

dựng cơ sở dữ liệu hệ gen biến thể ty thể và nhiễm sắc thể Y của một số dân

tộc người Việt Nam" thuộc nhiệm vụ khoa học và công nghệ cấp quốc gia do

Bộ Khoa học và Công nghệ quản lý (Mã số: 60/19-ĐTĐL.CN-XNT).

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã

luôn bên tôi, động viên và khích lệ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên

cứu của mình.

Mặc dù tôi đã cố gắng để hoàn thành đề tài nhưng không tránh khỏi

những thiếu xót nhất định.

Tôi rất mong nhận được sự đánh giá, nhận xét và đóng góp ý kiến của

các thầy cô giáo và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.

Xin chân thành cảm ơn!

Bình Định, tháng 08 năm 2022

Học viên

ĐOÀN THỊ HUYỀN TRANG

iii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Lý do chọn đề tài........................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................. 3

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 3

3.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 3

3.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................. 3

4. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 3

5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 3

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ..................... 5

1.1. Tổng quan về tình hình vô sinh và vô sinh nam.................................. 5

1.2. Gen TEX15 và vô sinh nam................................................................. 6

1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước............................... 7

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................ 7

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................ 10

1.4. Nguyên nhân gây vô sinh nam........................................................... 11

1.4.1. Môi trường................................................................................... 11

1.4.2. Nguyên nhân do nội tiết............................................................... 11

1.4.3. Độ tuổi sinh sản ........................................................................... 12

1.4.4. Bệnh lý ảnh hưởng đến khả năng sinh sản ở nam giới................ 13

1.4.5. Nguyên nhân di truyền ................................................................ 14

1.5. Tổng quan về đa hình nucleotide đơn................................................ 17

1.5.1. Đặc điểm đa hình nucleotide đơn ................................................ 17

1.5.2. Các phương pháp xác định đa hình nucleotide đơn .................... 19

iv

1.5.2.1. Phản ứng chuỗi polymerase - đa hình chiều dài đoạn giới hạn

(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism

- PCR-RFLP)...................................................................................... 19

1.5.2.2. Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao (Denaturing High￾Performance Liquid Chromatography - DHPLC).............................. 20

1.5.2.3. Phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (Single-strand

conformation polymorphism - SSCP)................................................ 20

1.5.2.4. Điện di trên gel nhạy cảm với cấu trúc (Conformation￾Sensitive Gel Electrophoresis - CSGE).............................................. 21

1.5.2.5. Phân tách hóa học nucleotide ghép đôi lệch (Chemical

Cleavage of Mismatch - CCM) .......................................................... 21

CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU ........................................................................................... 23

2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 23

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu...................................................... 23

2.3. Trang thiết bị và hóa chất .................................................................. 24

2.3.1. Trang thiết bị................................................................................ 24

2.3.2. Hóa chất....................................................................................... 24

2.4. Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 24

2.4.1. Tách chiết DNA tổng số .............................................................. 24

2.4.2. Phương pháp thiết kế mồi............................................................ 25

2.4.3. Khuếch đại vùng DNA có chứa đa hình TEX15 rs142485241... 25

2.4.4. Phương pháp PCR - RFLP .......................................................... 27

2.4.5. Phương pháp thống kê và so sánh ............................................... 29

2.5 Vấn đề y đức trong nghiên cứu y sinh học ......................................... 29

3.1. Kết quả xác định tần số alen và kiểu gen của đa hình TEX15

rs142485241 ở hai nhóm bệnh và nhóm chứng........................................ 31

3.1.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mẫu máu ......... 31

3.1.2. Khuếch đại vùng DNA có chứa TEX15 rs142485241................ 47

3.1.3. PCR - RFLP................................................................................. 50

3.2. Phân tích sự liên quan của đa hình TEX15 rs142485241 và bệnh vô

sinh nam.................................................................................................... 59

v

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................ 64

1. Tài liệu tiếng Anh................................................................................... 64

2. Tài liệu tiếng Việt................................................................................... 73

PHỤ LỤC

vi

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

95% CI 95% Confident interval Khoảng tin cậy 95%

AIS Androgen insensitivity

syndrome

Hội chứng không nhạy

cảm androgen

AR Androgen Thụ thể androgen

Array

CGH

Microarray-based

comparative genomic

hybridization

Lai so sánh hệ gen dựa trên

microarray

AZF Azoospermia factor Vùng yếu tố không tinh trùng

bp Base pair Cặp cơ sở (cặp nucleotide)

CCM

Chemical Cleavage of

Mismatch

Phân tách hóa học nucleotide ghép

đôi lệch

CNV Copy number variantion Biến dị số lượng bản sao

CSGE

Conformation-Sensitive

Gel Electrophoresis

Điện di trên gel nhạy cảm với cấu

trúc

ddNTP

Dideoxynucleotide tripho

sphate Dideoxynucleotide triphosphate

DHPLC

Denaturing High￾Performance Liquid

Chromatography Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao

DNA Deoxyribonucleic acid deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide

triphosphate

DSB Double-strand break Tách đôi sợi DNA

EDTA

Etylene diamine tetra

acetic acid

vii

EST Expressed sequence tags Các thẻ trình tự được thể hiện

FISH

Fluorescence in situ

hybridization

Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh

quang

GWAS

Genome-Wide

Association Study

Nghiên cứu dùng để xác định các

biến thể bộ gen có ý nghĩa thống kê

HWE Hardy – Weinberg

equilibrium

Trạng thái cân bằng Hardy –

Weinberg

NCBI

National Center for

Biotechnology

Information

Trung tâm Thông tin Công nghệ

sinh học Quốc gia

NGS

Next Generation

Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới

NOA

Non￾obstructive Azoospermia Azoospermia không tắc nghẽn

OD Optical density Mật độ quang học

OR Odd ratio Tỷ suất chênh

PCR Polemerase Chain

Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

RE Restriction Enzyme Enzyme giới hạn

RFLP

Restriction Fragment

Length Polymorphism. Hạn chế mảnh chiều dài đa hình

SCOS

Sertoli cell only

syndrome Hội chứng tế bào Sertoli đơn thuần

SSCP

Single-strand

conformation

polymorphism Phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn

STSs Sequence-Tagged Site Vị trí được gắn thẻ trình tự