Nghiên cứu biến nạp Gen vào đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

---------  --------

NGUYỄN TIẾN DŨNG

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG

(Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên-2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

---------  --------

NGUYỄN TIẾN DŨNG

Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60.42.30

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG

(Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN

Agrobacterium tumefaciens”

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: T.S. Nguyễn Văn Đồng

PGS.TS. Ngô Xuân Bình

Thái Nguyên-2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2008............. 5

Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau ............... 6

Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam ..................................... 7

Bảng 1.4. Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen........................................... 17

Bảng 1.5 Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa ......................................................... 20

Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy........................................................... 38

Bảng 3.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương sau 10 ngày ....... 45

Bảng 3.2. Khả năng kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ..................................47

Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen .............. 48

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen .... 53

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm ............... 54

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen....... 56

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biến nạp gen ........................ 57

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen............................ 58

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen .........59

Bảng 3.10. Hiệu quả chuyển gen vào một số giống đậu tương.............................. 62

Bảng 3.11. Số cây sau chọn lọc của một số giống đậu tương................................. 63

Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen với cặp mồi .. 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin................................................. 10

Hình 1.2. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật ........................... 12

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể ................................................................. 15

Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp ............................................................... 16

Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc vector pX2-H ................................................................. 31

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương................................................... 35

Hình 2.3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương .......................................... 37

Hình 3.1. Phát sinh tạo đa chồi ở một số giống đậu tương nghiên cứu ................... 46

Hình 3.2. Phát sinh rễ của một số giống đậu tương................................................ 48

Hình 3.3. Biểu hiện gus ở đậu tương khi được lây nhiễm với các chủng vi khuẩn .......... 49

Hình 3.4. Mẫu biến nạp plasmid pX2-H::gfp trong Agrobacterium chủng AGL1.. 51

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp ..................... 52

Hình 3.6. Chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM .................................... 60

Hình 3.7. Biểu hiện của gen gfp được chuyển vào các giống đậu tương ................ 63

Hình 3.8. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng đậu tương ........................... 64

Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR . ............................................................ 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AS : Acetosyringone

BAP : 6 - Benzylaminopurine

bp : base pair (cặp bazơ)

GFP : Green Fluorescent Protein

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

Et-Br : Ethidium Bromide

gus : -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase)

hpt : Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase

MSC : Multi - Cloning Site

NAA : α -Napthalene acetic acid

MS : Murashige and Skoog, 1962

LB : Luria Bertani

NOS : Nopalin Sythetase

OD : Optical Density (mật độ quang học)

PCR : Polymerase Chain Reaction

SDS : Sodium Dodecyl Sulfate

TAE : Tris-Acetate-EDTA

TE : Tris-EDTA

T- DNA : Transfer DNA (ADN chuyển)

Ti-Plasmid : Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật)

VIR : Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u)

X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid

2,4-D : Dichlorophenoxy acetic acid

& cs : và cộng sự

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1

2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2

3. Yêu cầu nghiên cứu........................................................................................... 2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................... 3

1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng ......................................................... 3

1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương ......................................................... 3

1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam ....................... 6

1.3.1.Trên thế giới.................................................................................................. 6

1.3.2. Ở Việt Nam................................................................................................... 7

1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen................... 9

1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự

nhiên ................................................................................................................... 9

1.4.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid........................................................ 9

1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA.............................................. 11

1.4.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen ........................................................... 11

1.4.5. Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật...................................... 13

1.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens................................................................................... 14

1.5.1. Vector nhị thể............................................................................................... 14

1.5.2. Hệ vector liên hợp ........................................................................................ 16

1.6. Gen chỉ thị ..................................................................................................... 17

1.6.1. Chỉ thị chọn lọc ........................................................................................... 17

1.6.2 Chỉ thị sàng lọc ............................................................................................. 18

1.7. Hệ thống tái sinh và biến nạp gen ở giống đậu tƣơng .................................. 20

1.7.1. Hệ thống tái sinh ở đậu tương ..................................................................... 20

1.7.2. Phương pháp biến nạp gen ở đậu tương...................................................... 21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...... 30

2.1. VẬT LIỆU....................................................................................................... 30

2.1.1. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm............................................................. 30

2.1.2. Hóa chất....................................................................................................... 30

2.1.3. Plasmid, primers và vi khuẩn..................................................................... 30

2.1.4. Vật liệu thực vật................................................................................ ............. 31

2.1.5. Địa điểm nghiên cứu....................................................................................... 32

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU................................................................................ 32

2.3. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu..................................................................... ... 32

2.3.1. Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt............. 32

2.3.2. Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens bằng phƣơng

pháp xung điện...................................................................................................... 33

2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn................................... 33

2.3.4. Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 34

2.3.5. Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose

2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh ......................................... 35

2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng ................................ 39

2.3.8 Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen ............................................................. 39

2.3.8.1. Sàng lọc thông qua gen chỉ thị GFP......................................................... 39

2.3.8.2. Phân tích PCR........................................................................................... 39

2.3.9. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và sử lý kết quả ........ 41

2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………….... 41

2.3.9.2. Phương pháp theo dõi, đánh giá............................................................... .42

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 44

3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu

tƣơng ..................................................................................................................... 44

3.1.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương ................................ 44

3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương

nghiên cứu............................................................................................................. 46