Luận văn xác định týp o virus lở mồm long móng ở việt nam bằng phương pháp RT PCR

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o

tr−êng ®¹i häc n«ng nghiÖp I

------------------

phan thanh tuÊn

X¸c ®Þnh týp O virus lë måm long mãng

ë ViÖt Nam b»ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR

LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp

Chuyªn ngµnh: Thó y

M· sè: 60.62.50

Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: TS. nguyÔn viÕt kh«ng

Hµ Néi - 2006

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- i

lêi cam ®oan lêi cam ®oan

T«i cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña riªng t«i. C¸c kÕt

qu¶ vµ sè liÖu thÓ hiÖn trong luËn v¨n lµ trung thùc vµ ch−a tõng ®−îc

sö dông ®Ó b¶o vÖ bÊt cø häc vÞ nµo.

T«i cam ®oan r»ng c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn v¨n ®Òu ®·

®−îc chØ râ nguån gèc.

T¸c gi¶ luËn v¨n

Phan Thanh TuÊn

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- ii

Lêi c¶m ¬n Lêi c¶m ¬n

§Ó hoµn thµnh luËn v¨n tèt nghiÖp, ngoµi sù cè g¾ng vµ nç lùc cña b¶n

th©n, t«i ®· nhËn ®−îc rÊt nhiÒu sù gióp ®ì quý b¸u cña c¸c c¸ nh©n vµ tËp

thÓ. Nh©n dÞp nµy, cho phÐp t«i ®−îc bµy tá lßng biÕt ¬n ch©n thµnh tíi:

Ban gi¸m hiÖu, c¸c thÇy c« gi¸o Khoa Sau ®¹i häc, Khoa Ch¨n nu«i

Thó y - Tr−êng §¹i häc N«ng nghiÖp I ®· ®µo t¹o, truyÒn t¶i kiÕn thøc khoa

häc cho t«i trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp t¹i tr−êng.

Ban l·nh ®¹o ViÖn Thó y cïng tËp thÓ c¸n bé, nh©n viªn- Bé m«n Ho¸

sinh- MiÔn dÞch- BÖnh lý, ViÖn Thó y, ®· t¹o mäi ®iÒu kiÖn gióp ®ì t«i thùc

hiÖn ®Ò tµi tèt nghiÖp.

§Æc biÖt, t«i xin bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi thÇy gi¸o:

TS. NguyÔn ViÕt Kh«ng, ng−êi ®· trùc tiÕp h−íng dÉn, tËn t×nh gióp ®ì t«i

thùc hiÖn ®Ò tµi vµ hoµn thµnh luËn v¨n.

T«i xin göi lêi c¶m ¬n tíi gia ®×nh, ng−êi th©n vµ toµn thÓ b¹n bÌ, ®·

lu«n quan t©m, ñng hé vµ ®éng viªn t«i trong suèt qu¸ tr×nh häc tËp vµ tiÕn

hµnh luËn v¨n.

T¸c gi¶ luËn v¨n

Phan Thanh TuÊn Phan Thanh TuÊn

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- iii

Môc lôc

Lêi cam ®oan i

Lêi c¶m ¬n ii

Môc lôc iii

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t v

Danh môc c¸c b¶ng vi

Danh môc c¸c h×nh vii

1. §Æt vÊn ®Ò 1

2. Tæng quan tµi liÖu vµ c¬ së khoa häc cña ®Ò tµi 3

2.1. Kh¸i niÖm bÖnh lë måm long mãng 3

2.2. T×nh h×nh bÖnh vµ nghiªn cøu vÒ bÖnh lë måm long mãng trªn thÕ giíi 3

2.3. T×nh h×nh bÖnh vµ nghiªn cøu vÒ bÖnh lë måm long mãng ë ViÖt Nam 19

2.4. Mét sè kü thuËt chÈn ®o¸n virus lë måm long mãng 22

2.5. Sù ®a d¹ng sinh häc cña c¸c týp virus lë måm long mãng vµ biÕn chñng 26

3. Néi dung, nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 29

3.1. §èi t−îng nghiªn cøu 29

3.2. §Þa ®iÓm nghiªn cøu 29

3.3. Thêi gian nghiªn cøu 29

3.4. Néi dung nghiªn cøu 29

3.5. Nguyªn liÖu 29

3.6. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 33

4. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 49

4.1. KÕt qu¶ phôc håi vµ nu«i cÊy tÕ bµo BHK-21 49

4.2. KÕt qu¶ g©y nhiÔm virus lë måm long mãng lªn tÕ bµo BHK-21 51

4.3. KÕt qu¶ thiÕt lËp RT-PCR ®Þnh týp virus lë måm long mãng 53

4.4. RT- PCR x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña virus PV02 54

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- iv

4.5. KÕt qu¶ RT-PCR ®Þnh týp virus lë måm long mãng PV02 56

4.6. RT-PCR víi týp O chuÈn vµ týp O PV02 58

4.7. KÕt qu¶ t¸ch vµ nh©n dßng s¶n phÈm PCR mÉu PV02 60

4.8. KÕt qu¶ gi¶i tr×nh tù gene virus lë måm long mãng chñng PV02 68

4.9. So s¸nh sequence gene m] ho¸ protein VP1 cña virus LMLM chñng

PV02 víi nh÷ng sequence ®] c«ng bè ë ng©n hµng gene thÕ giíi

(GenBank) 70

5. KÕt luËn vµ ®Ò nghÞ 73

5.1. KÕt luËn 73

5.2. §Ò nghÞ 73

Tµi liÖu tham kh¶o 74

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- v

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t

BHK-21 : Baby Hamster Kidney line 21

(TÕ bµo thËn chuét Hamster s¬ sinh dßng 21)

BSA : Bovine Serum Albumin (Albumin huyÕt thanh bß)

cDNA : Complementary DNA

CPE : Cytopathogenic effect (BÖnh tÝch tÕ bµo)

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

DNA : Deoxyribonucleic acid

DTT : Dithiothreitol

EDTA : Ethylene- Diamine- Tetra- Acetic

FAO : Food and Agriculture Organization

(Tæ chøc N«ng-L−¬ng Liªn hîp quèc)

FCS : Fetal Calf Serum (huyÕt thanh bµo thai bª)

FMD : Foot and Mouth Disease (bÖnh lë måm long mãng)

FMDV : Foot and Mouth Disease Virus

(Virus g©y bÖnh lë måm long mãng)

FMD-WRL : Foot and Mouth Disease-World Reference Laboratory

(Phßng thÝ nghiÖm tham chiÕu vÒ bÖnh lë måm long mãng)

LMLM : Lë måm long mãng

OIE : Office Internationale des Epizooties

(Tæ chøc DÞch tÔ ThÕ giíi)

PBS : Phosphate- Buffered- Saline

RNA : Ribonucleic acid

RT-PCR : Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- vi

Danh môc c¸c b¶ng

B¶ng 2.1. Týp virus LMLM n¨m 2005 t¹i khu vùc §«ng Nam ¸ 16

B¶ng 2.2. T×nh h×nh LMLM ë c¸c n−íc Nam Mü n¨m 2005 17

B¶ng 3.1. Ph¶n øng Reverse-Transciption 37

B¶ng 3.2. Thµnh phÇn premix thªm vµo ph¶n øng 37

B¶ng 3.3. Universal primer vµ c¸c primer ®Æc hiÖu víi c¸c týp virus

O, A, Asia1 38

B¶ng 3.4. Thµnh phÇn vµ thÓ tÝch cho 25 µl ph¶n øng 39

B¶ng 3.5. Chu tr×nh nhiÖt cho PCR nh©n gene FMDV 39

B¶ng 3.6. Thµnh phÇn tham gia ph¶n øng t¸ch DNA khái plasmid 46

B¶ng 3.7. C¸c b−íc kiÓm tra DNA plasmid 46

B¶ng 3.8. Thµnh phÇn c¸c chÊt tham gia ph¶n øng sequencing 47

B¶ng 3.9. Chu tr×nh nhiÖt cho ph¶n øng sequencing 47

B¶ng 4.1. Thµnh phÇn tham gia ph¶n øng t¸ch DNA khái plasmid 66

B¶ng 4.2. Thµnh phÇn c¸c chÊt tham gia ph¶n øng sequencing 69

B¶ng 4.3. Chu kú nhiÖt dïng cho ph¶n øng sequencing 69

B¶ng 4.4. Møc ®é t−¬ng ®ång cña gene VP1 chñng ph©n lËp PV02 víi c¸c

chñng kh¸c trªn thÕ giíi 71

Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- vii

Danh môc c¸c h×nh

H×nh 2.1. B¶n ®å ph©n bè bÖnh LMLM trªn thÕ giíi n¨m 2005 16

H×nh 2.2. S¬ ®å nguyªn lý ph¶n øng RT-PCR 23

H×nh 4.1. H×nh ¶nh tÕ bµo BHK-21 phôc håi vµ ph¸t triÓn theo thêi gian 50

H×nh 4.2. H×nh ¶nh tÕ bµo BHK-21 sau g©y nhiÔm virus PV02 (tr−íc

g©y nhiÔm, 24 vµ 48 giê sau g©y nhiÔm) 52

H×nh 4.3. S¶n phÈm RT-PCR sö dông c¸c cÆp primer ®Æc hiÖu týp ®èi

víi c¸c mÉu virus chuÈn 53

H×nh 4.4. S¶n phÈm RT-PCR dïng FMD uni-primer ®èi víi mÉu tÕ bµo

g©y nhiÔm virus PV02 55

H×nh 4. 5. S¶n phÈm RT-PCR trong ®Þnh týp virus LMLM PV02 56

H×nh 4.6. S¶n phÈm RT-PCR cña virus LMLM chñng ph©n lËp PV02 vµ

chñng tham chiÕu týp O, dïng c¸c cÆp primer chung cho c¸c

týp (PuniR-F) vµ cÆp måi ®Æc hiÖu cho týp O (P33/P38) 59

H×nh 4.7. S¶n phÈm RT-PCR sö dông cho nh©n dßng 61

H×nh 4.8. KiÓm tra s¶n phÈm PCR ®] ®−îc tinh khiÕt tõ agarose gel 62

H×nh 4.9. [A]- C¸c khuÈn l¹c mµu xanh vµ mµu tr¾ng mäc sau khi nu«i

cÊy tÕ bµo kh¶ biÕn. [B]- B¾t khuÈn l¹c cÊy chuyÓn sang m«i

tr−êng míi 64

H×nh 4.10. S¶n phÈm PCR thu ®−îc tõ m«i tr−êng nu«i cÊy c¸c khuÈn

l¹c mµu tr¾ng 65

H×nh 4.11. KÕt qu¶ kiÓm tra DNA t¸ch ®−îc tõ plasmid trªn agarose gel 67

H×nh 4.12. KÕt qu¶ kiÓm tra l−îng plasmid tr−íc khi sequence 68

H×nh 4.13. Gi¶i tr×nh tù gene VP1 ®] ®−îc dßng ho¸ ë plasmid 70

H×nh 4.14. KÕt qu¶ Blast tõ GenBank cña ®o¹n gene VP1 71