Luận văn thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn streptomyces griceus (NN2) và ứng dụng để sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-------
-------

NGUYỄN THỊ THẮM

THU NHẬN ENZYME CHITOSANASE TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN

STREPTOMYCES GRICEUS (NN2) VÀ ỨNG DỤNG ðỂ SẢN XUẤT

ðƯỜNG CHITOSANOLIGOSACCHARIDE (COS) CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

Mã số : 60.54.10

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ XUÂN MẠNH

HÀ NỘI - 2010

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận

này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng.

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện khoá luận

này ñã ñược cảm ơn và các thông tin ñược trích dẫn trong khoá luận này ñã

ñược ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm 2010

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thắm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của

bản thân, tôi ñã nhận ñược sự ñộng viên và giúp ñỡ rất lớn của nhiều cá nhân

và tập thể.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh,

Trưởng khoa - Khoa công nghệ thực phẩm - Trường ðại học Nông nghiệp Hà

Nội ñã tận tình giúp ñỡ, tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn

thành luận văn tốt nghiệp này.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy cô trong Khoa Công

nghệ thực phẩm và Viện ñào tạo sau ñại học trường ñại học Nông nghiệp Hà

Nội ñã tạo mọi ñiều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này.

Mặc dù ñã hết sức cố gắng, nhưng khoá luận của tôi không tránh khỏi

những thiếu sót và hạn chế. Vì vậy tôi kính mong nhận ñược sự góp ý, chỉ

bảo của thầy cô ñể giúp tôi có thể phát huy kiến thức một cách hiệu quả

sau khi ra trường.

Tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình và tất cả bạn bè ñã ñộng viên giúp

ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài và

hoàn thành bản luận văn này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2010

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thắm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC ðỒ THỊ viii

DANH MỤC SƠ ðỒ ix

DANH MỤC HÌNH ix

1. MỞ ðẦU 1

1.1. ðặt vấn ñề 1

1.2. Mục ñích và yêu cầu 2

1.2.1. Mục ñích 2

1.2.2. Yêu cầu 3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1. Chitosan 4

2.2. Enzyme chitosanase 5

2.2.1. Khối lượng phân tử 5

2.2.2. Khái niệm về enzyme chitosanase 5

2.2.3. Phân loại 6

2.2.4. Nguồn nguyên liệu ñể thu nhận enzyme chitosanase 7

2.2.5. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 9

2.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzyme

chitosanase từ vi sinh vật 11

2.2.7. Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzym chitosan 17

2.3. Hiệu quả của ñường oligosaccharide chức năng 21

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. iv

2.4. Chitosan oligosaccharide 23

2.4.1. Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (COS) 23

2.4.2. Tính năng của chitosan oligosaccharide ( COS ) 24

2.4.3. Ứng dụng chitosan và COS trong ñời sống 28

2.5. Những hướng sản xuất COS trong công nghiệp 33

2.5.1. Phương pháp hoá học 33

2.5.2. Phương pháp enzyme 34

2.6. Xạ khuẩn Streptomyces griseus (chủng NN2) 35

2.6.1. ðặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn 35

2.6.2. Khuẩn ti của xạ khuẩn 35

2.6.3. Khuẩn lạc của xạ khuẩn 36

2.5.4. ðặc ñiểm sinh lí, hóa sinh 36

2.7. Tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme chitosanase và chitosan

oligosaccharide (COS) 36

2.7.1. Trên thế giới 36

2.7.2. Tại Việt Nam 40

3. ðỐI TƯỢNG – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

3.1. ðối tượng nghiên cứu 42

3.2. Nội dung nghiên cứu 42

3.2.1.Thu nhận enzyme chitosanase 42

3.2.2. Thu nhận chitosanoligosaccharide (COS) 42

3.3. Phương pháp nghiên cứu 43

3.3.1. Phương pháp vi sinh 43

3.3.2. Phương pháp hóa sinh 43

3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 48

3.3.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. v

3.3.5. Xây dựng quy trình thu nhận enzyme chitosanase và ñường

chitosanoligosaccharide (COS) 54

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

4.1. Kết quả hoạt hóa và ñịnh tính khả năng sinh enzyme chitosanase

của xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) 57

4.2. Thu nhận enzyme chitosanase 59

4.2.1. Chọn lựa các ñiều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu xạ khuẩn

Streptomyces griceus (chủng NN2) ñể sinh tổng hợp chitosanase 59

4.2.2. Thu nhận enzyme thô 65

4.3. Xác ñịnh ñiều kiện tối ưu thu nhận chitosan oligosaccharide (COS) 71

4.3.1. Xác ñịnh ảnh hưởng của ñơn yếu tố ñến sự hình thành ñường

COS 71

4.3.2. Xác ñịnh các ñiều kiện ảnh hưởng ñến sự hình thành ñường COS

theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm 77

4.4. Quy trình sản xuất chitosan oligosaccharide sử dụng enzyme

chitosanase 83

5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 86

5.1. Kết luận 86

5.2. ðề nghị 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 88

PHỤ LỤC 96

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ

COS Chitosan oligosaccharide

DA Degree of deacetylation

DP Degree of polymerization

DNS Acid dinitro salisilic

E/S Tỷ lệ enzyme/ cơ chất

GlcN D- Glucosamine

GlcNAc N- acetyl-D- Glucosamine

Pro Protein

XOS Xylose oligosaccharide

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. vii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

2.1 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 5

2.2 Phân loại chitosanase dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu 7

2.3 Kiểu phân cắt của các loại chitosanase 9

2.4 ðiều kiện nhiệt ñộ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi

sinh vật sản sinh chitosanase 16

2.5 Phân tích thành phần cấu tạo của chitosan oligosaccharide bằng

phương pháp HPLC 24

2.6 Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới 37

4.1 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực

giao bậc 2, ba yếu tố và kết quả 60

4.2 Hệ số trong phương trình hồi qui và mức ý nghĩa 60

4.3 Hoạt tính enzyme chitosanase trước và sau khi cô ñặc 66

4.4 So sánh hoạt tính chitosanase tủa bằng muối ammoni sunfate trên

phân ñoạn 50 - 70% 69

4.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực

giao bậc 2, ba yếu tố và kết quả 78

4.6 Hệ số trong phương trình hồi qui và mức ý nghĩa 79

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. viii

DANH MỤC ðỒ THỊ

STT Tên ñồ thị Trang

2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ ñến khả năng sinh tổng hợp

chitosanase của Gongronella sp. JG 11

2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan tới khả năng sinh tổng hợp

chitosanase của Aspergillus sp. CJ 22-326 13

2.3 Hoạt tính chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037 khi nuôi cấy

trong môi trường chitosan với mức ñộ deacetyl hóa khác nhau 14

4.1 (a) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X1 (nhiệt ñộ, 0C), X2 (pH) và

X3 (nồng ñộ rỉ ñường, %) là tâm 62

4.1 (b) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X1 (nhiệt ñộ, 0C), X3 (nồng ñộ rỉ

ñường, %) và X2 (pH) là tâm 63

4.1 (c) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X2 (pH), X3 (nồng ñộ rỉ ñường, %)

và X1 (nhiệt ñộ, 0C) là tâm 64

4.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ ethanol và nồng ñộ muối amoni sunfate

tới hoạt tính riêng của chitosanase 67

4.3 Ảnh hưởng pH ñến sự hình thành ñường COS 72

4.4 Ảnh hưởng nhiệt ñộ ñến sự hình thành ñường COS 74

4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) ñến sự hình thành ñường COS 75

4.6 Ảnh hưởng thời gian ñến sự hình thành ñường COS 76

4.7 (a) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X2 (nhiệt ñộ), X3 (Tỷ lệ

enzyme/cơ chất) và X1 (pH) là tâm 80

4.7 (b) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X1 (pH), X3 (Tỷ lệ enzyme/cơ

chất) và X2 (nhiệt ñộ) là tâm 81

4.7 (c) ðồ thị biểu diễn mối quan hệ của X1 (pH), X2 (nhiệt ñộ) và X3 ( tỷ

lệ enzyme/cơ chất) là tâm 82

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. ix

DANH MỤC SƠ ðỒ

STT Tên sơ ñồ Trang

4.1 Quy trình nuôi cấy Streptomyces griseus (chủng NN2) ñể sinh

tổng hợp chitosanase 70

4.2 Quy trình thu nhận COS từ chitosan sử dụng enzyme chitosanase 84

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

2.1 Cấu trúc hoá học của chitosan 4

2.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 10

2.3 Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide 23

4.1 ðặc ñiểm khuẩn lạc xạ khuẩn NN2 57

4.2 Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu NN2

(phương pháp cấy chấm ñiểm) 58

4.3 Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu NN2

(phương pháp ñục lỗ thạch) 58

4.4 ðặc ñiểm hình thái tế bào xạ khuẩn NN2 59

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. 1

1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề

Thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học (CNSH), nó sẽ xâm nhập

vào mọi lĩnh vực của ñời sống. Công nghệ sinh học có ba cấp ñộ khác nhau:

Công nghệ sinh học truyền thống như các hoạt ñộng chế biến thực phẩm

(rượu, giấm, sữa chua, dưa muối, men bánh mì...), ủ phân, phơi ải ñất…Công

nghệ sinh học cận ñại với việc sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm

công nghệ lên men, công nghệ vi sinh vật (cồn, bia, dung môi hữu cơ, chất

kháng sinh, bột ngọt, thuốc trừ sâu sinh học…). Công nghệ sinh học hiện ñại chỉ

mới xuất hiện trong vài thập kỷ gần ñây. Công nghệ sinh học hiện ñại sử dụng

các kỹ thuật trao ñổi, sửa chữa, tổ hợp hoặc cải tạo vật chất di truyền ở mức ñộ

phân tử ñể tạo ra các protein hay một số sản phẩm khác mà vốn dĩ chúng ta

không tạo ra ñược.

Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận của công nghệ sinh học.

Trong một vài thập kỷ gần ñây việc nghiên cứu các ứng dụng của enzyme

ngày càng ñược quan tâm và chú trọng. Công nghệ enzyme ñã từng bước làm

thay ñổi và nâng cao chất lượng của một số quá trình công nghệ trong chế

biến thực phẩm cũng như trong nông nghiệp, dược phẩm, y tế...

Hàng năm lượng enzyme ñược sản xuất ra trên thế giới ñạt khoảng trên

300000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD và ñược phân bố trên các lĩnh vực

khác nhau. Tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các loại enzyme mới, và

nghiên cứu các ñặc ñiểm, tính chất, ứng dụng nó luôn là mục tiêu của các nhà

khoa học. Một trong số các enzyme ñó là enzyme chitosanase.

Chitosanase là một enzyme thủy phân liên kết nội phân tử cơ chất

chitosan. Enzyme chitosanase ñược ứng dụng chủ yếu ñể sản xuất ra chitosan

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............. 2

oligosaccharides (COS).

Chitosan có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công

nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử l í nước thải và bảo vệ môi

trường… Tuy nhiên, do khối lượng phân tử lớn, mạch phân tử dài, khó tan

trong nước nên người ta ñã tạo ra sản phẩm thuỷ phân của chitosan là

chitosanoligosaccharide (COS) nhằm khắc phục hạn chế, cũng như tăng

cường khả năng ứng dụng cho chitosan. Gần ñây, COS với tính năng ưu việt

của mình ñã ngày càng ñược sản xuất nhiều hơn và ñược ứng dụng rộng rãi

trong nhiều lĩnh vực, ñặc biệt là trong công nghệ thực phẩm với vai trò là

oligosaccharide chức năng.

COS có thể ñược thu nhận bằng phương pháp hoá học. Tuy nhiên,

phương pháp hiệu quả nhất ñể sản xuất sản phẩm này là phương pháp sinh

học sử dụng enzyme chitosanase. Enzyme chitosanase có thể thu nhận ñược

từ nhiều nguồn khác nhau như vi khuẩn, nấm, hay một số thực vật… Nhưng

enzyme thu nhận từ xạ khuẩn thường có hoạt tính cao hơn cả.

Chính vì những ứng dụng rất thiết thực của enzyme chitosanase và COS

ñến ñời sống của con người chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:

“Thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces griceus

(NN2) và ứng dụng ñể sản xuất ñường chitosanoligosaccharide (COS)

chức năng”.

1.2. Mục ñích và yêu cầu

1.2.1. Mục ñích

Thu nhận enzyme chitosanase có hoạt tính cao từ xạ khuẩn

Streptomyces griceus (chủng NN2) và ứng dụng ñể thu nhận ñường

chitosanoligosaccharide chức năng.