Khảo sát tỷ lệ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong sản phẩm kem có chứa sữa tại trung tâm Quatest3 theo tiêu chuẩn 46/2007/QĐ-BYT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

" KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM CÁC VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG SẢN PHẨM KEM CÓ CHỨA SỮA TẠI TRUNG TÂM

QUATEST3 THEO TIÊU CHUẨN 46/2007/QĐ-BYT "

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD:ThS. NGUYỄN VĂN MINH

ThS. TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT

SVTH: LÂM VĂN THẮNG

MSSV: 1153010771

Khóa: 2011-2015

Bình Dƣơng, ngày 26 tháng 05 năm 2015

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang I

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại học Mở Tp.Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm bộ môn

Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong

suốt quá trình học tập tại trường.

Thầy Nguyễn Văn Minh đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều cũng như

cho em những lời khuyên quý giá để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em

xin gửi đến thầy lời cảm ơn chân thành nhất.

Em cũng xin cảm ơn chị Trần Thị Ánh Nguyệt đã tạo điều kiện để em tiếp xúc

với môi trường làm việc thực tế, giúp em có cái nhìn toàn diện hơn về ngành Công

nghệ sinh học nói chung và ngành Kiểm nghiệm vi sinh vật nói riêng, qua đó thấy

được những phẩm chất có có của một Kiểm nghiệm viên là trung thực cẩn thận, và

đặc biệt là không ngừng học hỏi. Em cám ơn chị rất nhiều ạ.

Em xin gửi lời cảm ơn đến cô Ái Lâm, cô Phương Dung, chị Thu Hồng, anh

Thanh, chị Diệu Thu, chị Phương, chị Phượng cùng với các anh chị và các bạn đang

làm việc tại phòng Thử nghiệm vi sinh-GMO, Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo

lƣờng chất lƣợng 3 (QUATEST3) đã nhiệt tình hướng dẫn và dành cho em những

tình cảm quý giá trong suốt quá trình em thực tập và làm khóa luận tốt nghiệp.

Con xin gửi lời tri ân đến Cha, Mẹ và các anh chị, người thân trong gia đình đã

luôn ủng hộ, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất.

Xin cảm ơn tất cả bạn bè thân yêu lớp DH11SHO3 đã cùng tôi chia sẽ biết bao

buồn vui cũng như đã hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt những năm tháng dưới

mái trường Đại học Mở Tp.Hồ Chí Minh.

Em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người

Sinh viên LÂM VĂN THẮNG

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................. I

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang II

MỤC LỤC....................................................................................................................... I

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................................IV

DANH MỤC BẢNG......................................................................................................V

DANH MỤC BIỂU ĐỒ................................................................................................VI

DANH MỤC HÌNH ẢNH.......................................................................................... VII

DANH MỤC PHỤ LỤC............................................................................................VIII

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1

PHẦN 1. TỔNG QUAN.................................................................................................4

1.1. Tồng quan về QUATEST 3...................................................................................4

1.1.1. Những nét chung.............................................................................................4

1.1.2. Nhiệm vụ ........................................................................................................4

1.1.3. Phòng thử nghiệm vi sinh – GMO..................................................................5

1.2. Tổng quan về kem .................................................................................................6

1.2.1. Nguồn gốc:......................................................................................................6

1.2.2. Thành phần của kem.......................................................................................7

1.2.3. Các vi sinh vật trong kem...............................................................................7

1.3. Đại cương về các vi sinh vật gây bệnh thường hiện diện trong kem ....................7

1.3.1. Đại cương về Coliforms..................................................................................7

1.3.2. Đại cương về Escherichia coli........................................................................8

1.3.3. Đại cương về Staphylococus aureus.............................................................11

1.3.4. Đại cương về Listeria monocytogenes .........................................................14

1.3.5. Đại cương về Salmonella..............................................................................17

1.3.6. Giới thiệu về phương pháp PCR...................................................................22

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP...............................................................31

2.1. Vật liệu ................................................................................................................31

2.2. Thiết bị - Hóa chất:..............................................................................................31

2.3. Phương pháp kiểm nghiệm:.................................................................................32

2.3.1. Quy trình chung ............................................................................................32

2.3.2. Mô tả mẫu:....................................................................................................32

2.3.3. Đồng nhất mẫu:.............................................................................................32

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang III

2.3.4. Phân tích mẫu: ..............................................................................................32

2.3.5. Lưu trữ, bảo quản mẫu:.................................................................................33

2.4. Phương pháp phân tích vi sinh vật ......................................................................33

2.4.1. Định lượng Coliforms trong thực phẩm bằng phương pháp đếm đĩa theo

ISO 4832:2006........................................................................................................33

2.4.2. Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN theo FDA 2013 (Chap 4G).....34

2.4.3. Định lượng Staphylococus aureus bằng phương pháp MPN theo AOAC

2013 (987.09 ).........................................................................................................37

2.4.4. Định danh Listeria monocytogenes: TCVN 7700-1:2007, ISO 11290 – 1

: 1996 / Amd.1 : 2004. ............................................................................................38

2.4.5. Định tính Salmonella: TCVN 4829:2005 Sửa đổi lần 1 : 2008 (ISO 6579 :

2002/Amd.1 : 2007)................................................................................................42

2.4.6. Tiến hành định tính Salmonella.spp, Listeria monocytogenes bằng

phương pháp PCR song song với phương pháp truyền thống................................48

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................54

3.1. Kết quả mô tả mẫu:..............................................................................................54

3.2. Kết quả đánh giá vi sinh vật trong mẫu...............................................................57

3.2.1. Quy định về chỉ tiêu kiểm nghiệm................................................................57

3.2.2. Kết quả đánh giá vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp truyền thống....58

3.2.3. Kết quả định tính Salmonella spp. và Listeria mocytegense trong mẫu

bằng phương pháp PCR..........................................................................................69

3.2.4. Kết quả và nhận xét chung............................................................................71

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................74

4.1. Kết luận ...............................................................................................................74

4.2. Đề nghị ................................................................................................................74

Tài liệu tham khảo :.....................................................................................................75

PHẦN PHỤ LỤC..............................................................................................................i

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang IV

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APHA American Public Health Association

AOAC Association of Official Analytical Chemists

BYT Bộ Y tế

BS British Standards

Đ Đạt

GMO Genetically Modified Organism

GMP Good Manufacturing Pratice

IEC International Engineering Consortium

ISO International Organization for Standardization

KĐ Không đạt

KPH Không phát hiện

QUATEST 3 Trung tâm kỹ thuật đo luờng chất luợng 3

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points

USFDA United States Food and Drug Administration

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang V

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu kem chứa sữa. ........33

Bảng 2.2 Bảng tóm tắt các phản ứng của Listeria spp. .................................................42

Bảng 2.3 Các phản ứng sinh hóa của các chủng Salmonella ........................................47

Bảng 2.4 Các phản ứng kháng huyết thanh thử khẳng định..........................................48

Bảng 2.5 Điều kiện để nuôi cấy các vi sinh vật.............................................................48

Bảng 2.6 Mồi đặc trưng cho từng loại vi sinh vật .........................................................49

Bảng 2.7 Nồng độ các thành phần phản ứng PCR phát hiện các vi sinh vật:

Salmonella spp và Listeria monocygenes ......................................................................50

Bảng 2.8 Chương trình nhiệt trên máy PCR..................................................................51

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá mô tả mẫu...........................................................................54

Bảng 3.2 Giới hạn vi sinh vật trong thực phẩm không được phép................................57

vượt quá giới hạn được quy định tại bảng dưới đây: .....................................................57

Bảng 3.3 Kết quả định lượng Coliforms trong các mẫu ................................................58

Bảng 3.4 Kết quả định tính và định lượng E.coli trong các mẫu ..................................60

Bảng 3.5 Kết quả định lượng Staphylococus aureus trong các mẫu............................62

Bảng 3.6 Kết quả định tính Listeria monocytogenes trong các mẫu .............................64

Bảng 3.7 Kết quả định tính Salmonella trong các mẫu .................................................66

Bảng 3.8 Kết quả điện di các mẫu Salmonella spp. và Listeria monocytogenes phân

lập từ các mẫu kem trên thạch agarose ..........................................................................69

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang VI

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biều đồ 3.1: Kết quả thu được sau khi đánh giá thử nghiệm các chỉ tiêu trong các

mẫu kem có chứa sữa .....................................................................................................72

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang VII

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Kem giải khát bổ dưỡng (Internet). .................................................................7

Hình 1.2: E. coli dưới kính hiển vi điện tử ( Internet )....................................................8

Hình 1.3: Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi điện tử (Internet) .........................11

Hình 1.4: Listeria monocytogenes dưới kính hiển vi (Internet)....................................14

Hình 1.5. Vi khuẩn Salmonella (Internet). ....................................................................18

Hình 1.6 Vị trí của các kháng nguyên của Salmonella................................................21

Hình 1.7 Nguyên tắc của PCR là nhân bản DNA đích qua các chu kỳ nhiệt................24

Hình 1.8: Sơ đồ khối minh họa nguyên tắc hoạt động của máy luân nhiệt với buồng

ủ nhiệt Peltier .................................................................................................................27

Hình 1.9: Hình vẽ minh họa cơ chế hoạt động chống ngoại nhiễm của UNG.............28

Hình 2.1: Quy trình chung trong kiểm nghiệm mẫu .....................................................32

Hình 2.2 Cấy & đọc kết quả phản ứng CAMP.............................................................41

Hình 3.1 Kết quả điện di đoạn gen đặc trưng của Salmonella trên gel agarose 2% .....71

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang VIII

DANH MỤC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH...............................................................................................i

Hình 1 Khuần lạc Coliforms trên môi trường VRBA. ......................................................i

Hình 2 Phản ứng IMViC.................................................................................................i

Hình 3 Môi trường RVS trước và sau khi cấy dịch khuẩn .............................................ii

Hình 4 Môi trường XLD trước và sau khi cấy................................................................ii

Hình 5 Phản ứng sinh hóa trên môi trường TSI agar.................................................... iii

Hình 6 Phản ứng urease: âm tính (trái), dương tính (phải)........................................... iii

Hình 7 Môi trường LDC trước(A) và sau khi cấy vi khuẩn (B:dương tính, C âm

tính) ................................................................................................................................ iii

Hình 8: Phản ứng phát hiện β-galactosidase(A: âm tính; B dương tính)........................iv

Hình 9 Phản ứng indol (A:âm tính, B: dương tính) ......................................................iv

Hình 10 Phản ứng VP (A:âm tính, B: dương tính) .......................................................iv

Hình 11 E.coli trên môi trường EMB ..............................................................................v

Hình 12 L. monocytogenes trên môi trường ALOA ........................................................v

Hình 13 Phản ứng coagulase............................................................................................v

Hình 14 Khuẩn lạc S. aureus trên môi trường BP ...........................................................v

PHỤ LỤC 2 : CÁC HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƢỜNG ĐƢỢC SỬ DỤNG..............vi

1. Violet red bile lactose agar (VRBL)........................................................................vi

2. Brilliant green bile broth (BGB)..............................................................................vi

3. Butterfield's buffer phosphate diluents....................................................................vi

4. Phẩm nhuộm Gram.................................................................................................vii

5. Lauryl tryptose broth ( LST )..................................................................................vii

6. EC broth................................................................................................................ viii

7. Tryptone................................................................................................................ viii

8. Butterfield's phosphate buffered........................................................................... viii

9. L - EMB agar...........................................................................................................ix

10. MRVP broth.........................................................................................................ix

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang IX

11. Brain heart infusion broth (BHI broth) ................................................................ix

12. Baird - Parker agar ................................................................................................x

13. Huyết thanh thỏ/ Rabbit plasma...........................................................................xi

14. Trypticase soy broth với 10 , NaCl và 1 sodium pyruvate...........................xi

15. Nước muối sinh lý/ Physiological salt solution 0.85 %.......................................xi

16. Half Fraser broth .................................................................................................xii

17. Fraser broth (ISO 11290-1:1996)...................................................................... xiii

18. Oxford ............................................................................................................... xiii

19. Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA) ............................... xiii

20. Tryptone soya yeast extract agar (TSYEA) (ISO 11290-1:1996) ......................xv

21. Tryptone soya yeast extract broth (TSYEB) (ISO 11290-1:1996)....................xvi

22. Molity agar (ISO 11290-1:1996) .......................................................................xvi

23. Blood agar. .........................................................................................................xvi

24. 10.H2O2 3 %..................................................................................................... xvii

25. Rappaport-Vassilliadis medium with soya (RVS broth). ................................ xvii

26. Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn broth).............. xviii

27. Modified semi-solid Rappaport-Vasiliadis medium (MSRV)...........................xix

28. Xylose - Lysine desoxycholate agar (XLD) .......................................................xx

29. Hektoen enteric agar (HE) ..................................................................................xx

30. Bismuth sulfite agar (BS) (Wilson và Blair)......................................................xxi

31. Triple sugar iron agar (TSI) ...............................................................................xxi

32. Tryptone ........................................................................................................... xxii

33. MR - VP medium............................................................................................. xxii

34. Christensen’s urea agar. ................................................................................... xxii

35. Nutrient agar ................................................................................................... xxiii

36. L-Lysine decarboxylation medium. ................................................................ xxiii

37. Semi - solid nutrient agar. ................................................................................xxiv

38. Nước muối sinh lý............................................................................................xxiv

39. ONPG solution.................................................................................................xxiv

40. Reagents...........................................................................................................xxiv

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp

SVTH Lâm Văn Thắng Trang X

41. Kháng huyết thanh: O, H, Vi ............................................................................xxv