Khảo sát mức độ Methyl tạo đảo CpG thuộc vùng Promoter củaB các Gen DAPK và APC trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ ung thư cổ tử cung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC GEN DAPK VÀ APC

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ UNG THƢ CỔ

TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm

MSSV: 1153010395

Khóa: 2011 – 2015

TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

THUỘC VÙNG PROMOTER CỦA CÁC GEN DAPK VÀ APC

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ UNG THƢ CỔ

TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SHPT

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS.TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

SVTH: Nguyễn Tấn Liêm

MSSV: 1153010395

Khóa: 2011 – 2015

GVHD ký xác nhận

TP. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

ii

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp đánh dấu cho một bước ngoặc rất quan trọng trong quãng

đời sinh viên và để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này em đã nhận được rất nhiều

sự hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình, những lời động viên chân thành từ Thầy, Cô,

gia đình và bạn bè.

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh

Học, Trường Đại học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh đã tâm huyết, tận tình giảng dạy

và truyền đạt kiến thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho chuyên đề khóa luận tốt

nghiệp này.

Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Cô PGS. TS. Lê Huyền Ái

Thúy và Cô ThS. Trƣơng Kim Phƣợng đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ

và truyền đạt những kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để

em hoàn thành tốt trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí

nghiệm sinh học phân tử đã quan tâm, giúp đỡ tận tình tôi trong suốt quá trình thực

hiện đề tài.

Cuối cùng con xin cảm ơn Ba, Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, ủng hộ

cho con, tạo mọi điều kiện tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình.

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người Thầy, người Cô đáng kính khoa

Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP. Hồ Chí Minh, xin chúc Thầy Cô

ngày càng gặt hái được nhiều thành công.

Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt công việc học tập của mình tại

trường và thành công trong cuộc sống.

Xin chân thành cảm ơn.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Tấn Liêm

iii

MỤC LỤC

Phần I. Tổng quan .......................................................................................................1

I.1. Tổng quan ung thư................................................................................................1

I.1.1. Khái niệm ung thư .............................................................................................1

I.1.2. Phân loại ung thư ...............................................................................................1

I.1.3. Ung thư cổ tử cung ............................................................................................2

I.1.4. Các nguyên nhân dẫn đến ung thư cổ tử cung...................................................2

I.1.4.1. Thuốc lá ..........................................................................................................2

I.1.4.2. Thuốc ..............................................................................................................3

I.1.4.3. Virus HPV (Human Papiloma virus)..............................................................3

I.1.4.4. Độ tuổi ............................................................................................................5

I.1.4.5. Yếu tố di truyền và chủng tộc.........................................................................5

I.2. Tình hình mắc bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam.....................5

I.2.1. Tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới ........................................................5

I.2.2. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam.........................................................6

I.3. Tổng quan về Epigenetics và sự methyl hóa ........................................................6

I.3.1. Epigenetics.........................................................................................................6

I.3.2. Sự methyl hóa DNA ..........................................................................................7

I.3.3. Đảo CpG ............................................................................................................8

I.3.4. Sự biến đổi Histone..........................................................................................10

I.3.5. microRNA........................................................................................................10

I.4. Gen DAPK (Death-associated protein kinase)...................................................11

I.4.1. Định nghĩa........................................................................................................11

iv

I.4.2. Cơ chế hoạt động và chức năng của protein DAPK........................................11

I.4.3. Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa của gen DAPK trong ung thư................13

I.5. Gen APC (Adenomatous polyposis coli).............................................................15

I.5.1. Định nghĩa........................................................................................................15

I.5.2. Cơ chế hoạt động và chức năng của protein APC ...........................................15

I.5.3. Tình hình nghiên cứu sự methyl hóa của gen APC .........................................17

I.5.4. Phương pháp nghiên cứu sự methyl hóa..........................................................19

I.5.4.1. Phương pháp MSP (Methylation Specific PCR)..........................................19

I.5.4.2. Phương pháp Nested MSP............................................................................20

Phần II. Vật liệu và phương pháp .............................................................................21

II.1. Vật liệu ..............................................................................................................21

II.2. Phương pháp......................................................................................................21

II.2.1. Khai thác dữ liệu.............................................................................................21

II.2.2. Khảo sát in silico ............................................................................................21

II.2.2.1. Thu thập trình tự gen mục tiêu, xác định vị trí vùng cần tìm......................21

II.2.2.2. Phương pháp đánh giá, thiết kế mồi............................................................21

II.2.3. Khảo sát in vitro .............................................................................................22

II.2.3.1. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm Pap’smear..........................................22

II.2.3.2. Xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau tách chiết ........................24

II.2.3.3. Biến đổi DNA bằng sodium bisulfite với bộ kit Zymo Research ...............24

II.2.3.4. Thực hiện phản ứng MSP............................................................................25

II.2.3.5. Điện di trên gel agarose...............................................................................27

II.2.3.6. Giải trình tự .................................................................................................28

Phần III. Kết Quả Và Thảo Luận ..............................................................................29

v

III.1. Khai thác dữ liệu ..............................................................................................29

III.1.1. Bộ dữ liệu về tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen DAPK ở các

loại ung thư và ung thư cổ tử cung............................................................................30

III.1.2. Bộ dữ liệu về tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC ở các

loại ung thư và ung thư cổ tử cung............................................................................38

III.2. Khảo sát in sillico.............................................................................................45

III.2.1. Thu thập trình tự gen DAPK, gen APC.........................................................45

III.2.1.1. Thu thập trình tự gen DAPK ......................................................................45

III.2.1.2. Thu thập trình tự gen APC .........................................................................46

III.2.2. Khảo sát vùng promoter gen DAPK (Death associated protein kinase), APC

(Human adenomatous polysis coli)...........................................................................47

III.2.2.1. Khảo sát vùng promoter gen DAPK...........................................................47

III.2.2.2. Khảo sát vùng promoter gen APC..............................................................48

III.2.3. Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP.............................................................49

III.2.3.1. Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP trên gen DAPK................................49

III.2.3.2. Thu thập hệ mồi cho phản ứng MSP trên gen APC...................................51

III.2.4. Tìm hiểu thông số vật lý của mồi tham khảo................................................51

III.2.4.1. Thông số vật lý của cặp mồi gen DAPK....................................................53

III.2.4.2. Thông số vật lý của cặp mồi gen APC.......................................................55

III.3. Khảo sát in vitro ...............................................................................................57

III.3.1. Tách chiết DNA và kiểm tra DNA bộ gen sau khi tách chiết.......................57

III.3.2. Kết quả phản ứng MSP các mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu của gen

DAPK, APC...............................................................................................................58

III.3.2.1. Kết quả phản ứng MSP các mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu của gen

DAPK ........................................................................................................................58

vi

III.3.2.2. Kết quả phản ứng MSP các mẫu bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu của gen

APC ...........................................................................................................................60

III.3.3. Kết qủa giải trình tự sản phẩm MSP trên gen DAPK....................................62

Phần IV. Kết Luận và Đề Nghị .................................................................................65

IV.1. Kết luận............................................................................................................65

IV.2. Đề Nghị............................................................................................................65

Phần V. Tài Liệu Tham Khảo ...................................................................................66

Phần VI. Phụ lục .......................................................................................................89

vii

MỤC LỤC HÌNH VÀ BẢNG

Hình I. 1. Quá trình khởi phát và diễn tiến của ung thư .............................................1

Hình I. 2. Số bệnh nhân nhiễm và tử vong do ung thư cổ tử cung gây ra trên Thế

giới...............................................................................................................................5

Hình I. 3. Các quá trình biến đổi Epigenetics ............................................................7

Hình I. 4. Quá trình methyl hóa DNA.........................................................................7

Hình I. 5. Quá trình methyl hóa ..................................................................................8

Hình I. 6. Methyl hóa DNA trong tế bào bình thường và tế bào ung thư..................9

Hình I. 7. Định vị của gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9........................................11

Hình I. 8. Con đường chu trình chết của tế bào ........................................................13

Hình I. 9. Định vị của gen APC trên nhiễm sắc thể số 5...........................................15

Hình I. 10. Con đường điều hòa tín hiệu Wnt trong màng nguyên sinh chất và các

phức hợp trong tế bào chất........................................................................................17

Hình I. 11. Nguyên tắc của phản ứng MSP...............................................................19

Hình II. 1. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi DAPK-MR, DAPK-MF,

DAPK-UR, APC-MR, APC-MF, APC-UR, APC-UF..............................................27

Hình III. 1. Tần suất methyl hóa của gen DAPK trong các loại ung thư ..................35

Hình III. 2. Phương pháp sử dụng nghiên cứu sự methyl hóa DNA của gen DAPK

trong các loại ung thư................................................................................................36

Hình III. 3. Mẫu sử dụng nghiên cứu sự methyl hóa DNA của gen DAPK trong các

loại ung thư................................................................................................................36

Hình III. 4. Tần suất methyl hóa của gen APC trong các loại ung thư .....................42

Hình III. 5. Phương pháp sử dụng nghiên cứu sự methyl hóa của gen APC trong các

loại ung thư................................................................................................................42

viii

Hình III. 6. Mẫu sử dụng nghiên cứu sự methyl hóa của gen APC trong các loại ung

thư..............................................................................................................................43

Hình III. 7. Định vị gen DAPK trên nhiễm sắc thể số 9............................................47

Hình III. 8. Định vị của đảo CpG trên vùng promoter của gen DAPK.....................48

Hình III. 9. Định vị gen APC trên nhiễm sắc thể số 5 ..............................................48

Hình III. 10. Định vị của đảo CpG trên vùng promoter gen APC ............................49

Hình III. 11. Cấu trúc vùng promoter của gen DAPK...............................................54

Hình III. 12. Vị trí CpG và trình tự nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng

promoter của gen DAPK ...........................................................................................55

Hình III. 13. Cấu trúc vùng promoter gen APC........................................................56

Hình III. 14. Vị trí CpG và trình tự nhận biết của các nhân tố phiên mã trên vùng

promoter của gen APC ..............................................................................................57

Hình III. 15. Kết quả điện di sản phẩm MSP ở các mẫu CD....................................58

Hình III. 16. Kết quả điện di sản phẩm MSP ở các mẫu CA....................................61

Hình III. 17. Kết quả giải trình tự mẫu CD1-A với cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR

...................................................................................................................................63

Bảng II. 1. Thành phần phản ứng PCR cho cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR, APC￾MF, APC-MR............................................................................................................26

Bảng II. 2. Thành phần phản ứng PCR cho cặp mồi DAPK-UF, DAPK-UR, APC￾UF, APC-UR. ............................................................................................................26

Bảng III. 1. Các công trình nghiên cứu khoa học được thu thập trên NCBI ............29

Bảng III. 2. Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen DAPK ở các loại ung

thư..............................................................................................................................31

Bảng III. 3. Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen DAPK trong các giai

đoạn ung thư cổ tử cung khác nhau và các phương pháp xác định tính chất methyl

hóa khác nhau............................................................................................................37

ix

Bảng III. 4. Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của các gen DAPK trong ung

thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường ..............................................................38

Bảng III. 5. Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC ở các loại ung

thư..............................................................................................................................40

Bảng III. 6. Tần suất methyl hóa trên vùng promoter của gen APC trong các giai

đoạn ung thư cổ tử cung khác nhau và các phương pháp xác định tính chất methyl

hóa khác nhau............................................................................................................44

Bảng III. 7. Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của các gen APC trong ung

thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường ..............................................................45

Bảng III. 8. Trình tự gen DAPK thu thập trên ngân hàng gen ..................................45

Bảng III. 9. Trình tự gen APC thu thập trên ngân hàng gen .....................................46

Bảng III. 10. Thông tin cặp mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPK-UF và DAPK-UR

cho phản ứng MSP ....................................................................................................50

Bảng III. 11. Thông tin cặp mồi APC-MF, APC-MR, APC-UF, APC-UR cho phản

ứng MSP....................................................................................................................51

Bảng III. 12. Khảo sát các thông số vật lý của mồi DAPK-MF, DAPK-MR, DAPK￾UF, DAPK-UR..........................................................................................................53

Bảng III. 13. Khảo sát các thông số vật lý của mồi APC-MF, APC-MR, APC-UF,

APC-UR ....................................................................................................................55

Bảng III. 14. Tính chất methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen DAPK ở các

mẫu CD .....................................................................................................................59

Bảng III. 15. Tính chất methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen APC ở các

mẫu CA .....................................................................................................................61

x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ACCP American College of Clinical Pharmacy

AMPK Adenosine monophosphate-activated protein kinase

APC Adenomatous Polyposis Coli

ARF Alternate reading frame

BER Breast cancer

BSP Bisulfite specific PCR

CER Cervical cancer

CK1α Casein kinase

COL Colorectal cancer

CpG Cystonine phosphodiester Guanine

Cs cộng sự

DAPK Death- associated protein kinase

DES Diethylstilbestrol

DNMT DNA Methyltransferase

DRP-1 Dynamin-Related Protein 1

Dsh Dishevelled

E1A Adenovirus early region 1A

E2F-1 E2F Transcription Factor 1

EB1 End-binding protein 1

ERK Extracellular Signal-Regulated Kinase

Fz Frizzled

GAIP G Alpha Interacting Protein

GAS Gastric cancer

GDP Guanosine-5’-diphosphate

GSK3β Glycogen synthase kinase 3

GTP Guanosine-5’-triphosphate

HPV Human Papiloma virus

IARC Interntional Agency for Research on Cancer

ID4 Inhibitor of DNA binding 4

xi

IDT Integrated DNA Technology

INF Interferon

LEU Leukeemia cancer

LIV Liver cancer

LRP Lipoprotein receptor-related protein

LUN Lung cancer

Mdm2 Mouse double minute 2 homolog

MF Methyl Forward

miRNA microRNA

MR Methyl reverse

mTOR Mechanistic Target of Rapamycin

MyC Myc Avian Myelocytomatosis viral oncogene homolog

NAS Nasopharylgeal carcinoma

Ocs Oral contraceptives

PCR Polymerase chain reaction

QMSP Qualitative Methylation specific PCR

Raf Rapidly Accelerated Fibrosarcoma

SAM S-adenyl methione

SAM Sterile Anpha motif

Tcf T cell factor

Tm Temperature mealt

TNF Tumor necrosis factor

TSC Tuberous sclerosis

UF Unmethyl Forward

UR Unmethyl reverse

WHO World Health Organization

Wnt Wingless –type mouse mammary tumor virus integration site

ZIPK Zipper-Interacting Protein kinase

β-TrCP Beta-Transducin Repeat Containing E3 Ubiquitin protein Ligase

CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia