Khảo sát mức độ Methyl hóa tại đảo CpG thuộc vùng Promoter các GEN ABC và p16IN4α trên nhóm bệnh nhân có nguy cơ ung thư cổ tử cung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

THUỘC VÙNG PROMOTER CÁC GEN APC VÀ p16INK4a

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ

UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

MSSV: 1153010160

Khóa: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

GVHD ký xác nhận

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HÓA TẠI ĐẢO CpG

THUỘC VÙNG PROMOTER CÁC GEN APC VÀ p16INK4a

TRÊN NHÓM BỆNH NHÂN CÓ NGUY CƠ

UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SHPT

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƯƠNG KIM PHƯỢNG

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào

MSSV: 1153010160

Khóa: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

Khóa Luận Tốt Nghiệp

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào Trang i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến các quý thầy, cô khoa Công Nghệ

Sinh Học, trường Đại Học Mở thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy và truyền đạt kiến

thức cơ bản để giúp em làm cơ sở cho chuyên đề khóa luận tốt nghiệp này.

Em xin gửi lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến Cô Lê Huyền Ái Thúy và Cô

Trương Kim Phượng đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh

nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài này.

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các bạn của tôi, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm sinh

học phân tử đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng con xin cảm ơn Ba, Mẹ, cảm ơn gia đình đã luôn bên con, tạo mọi điều kiện

tốt nhất để con hoàn thành việc học của mình.

Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả người thầy, người cô đáng kính khoa Công

nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở Tp. Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày càng gặt

hái được nhiều thành công trong công việc.

Tôi xin chúc các bạn của tôi sẽ hoàn thành tốt chuyên đề khóa luận tốt nghiệp của

mình và thành công trong cuộc sống.

Xin chân thành cảm ơn.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Anh Đào

Tháng 5/2015

Khóa Luận Tốt Nghiệp

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào Trang ii

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG......................................................................................................vii

DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... viii

PHẦN I. TỔNG QUAN...................................................................................................3

I.1. Tổng quan về ung thƣ.............................................................................................3

I.1.1. Khái niệm ung thƣ............................................................................................3

I.1.2. Các yếu tố nguy cơ ..........................................................................................3

I.1.3. Phân loại ung thƣ ............................................................................................4

I.1.4. Ung thƣ cổ tử cung ..........................................................................................4

I.1.5. Tình hình ung thƣ cổ tử cung trên thế giới ......................................................6

I.1.6. Tình hình ung thƣ cổ tử cung ở Việt Nam.......................................................6

I.1.7. Yếu tố nguy cơ dẫn đến ung thƣ cổ tử cung ....................................................7

I.2. Epigenetics ...........................................................................................................10

I.2.1. Methyl hóa DNA............................................................................................10

I.3. Tổng quan về gen APC.........................................................................................12

I.3.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen APC....................................................12

I.3.2. Các công trình nghiên cứu khoa học về tính chất methyl hóa gen APC........14

I.4. Tổng quan về gen p16INK4a

...................................................................................15

I.4.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen p16INK4a

...............................................15

I.4.2. Tình hình nghiên cứu về gen p16INK4a

............................................................16

I.5. Các phƣơng pháp phân tích sự methyl hóa DNA.................................................17

I.5.1. Phƣơng pháp MSP .........................................................................................17

Khóa Luận Tốt Nghiệp

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào Trang iii

I.5.2. Phƣơng pháp Nested MSP .............................................................................19

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................20

II.1. Vật liệu................................................................................................................20

II.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.....................................................................................20

II.2.1. Khai thác dữ liệu...........................................................................................20

II.2.2. Khảo sát in silico ..........................................................................................20

II.2.3. Khảo sát thực nghiệm ...................................................................................21

PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................................28

III.1. KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO GEN APC....................28

III.1.1. Kết quả khai thác dữ liệu.............................................................................28

III.1.2. Kết quả khảo sát in silico gen APC.............................................................34

III.1.2.1. Thu thập trình tự gen ................................................................................34

III.1.2.2. Thu thập bộ mồi cho phản ứng MSP........................................................35

III.1.3. Đánh giá các thông số vật lý của mồi..........................................................36

III.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU GEN p16INK4a

.........................................................42

III.2.1. Kết quả khai thác dữ liệu.............................................................................42

III.2.2. Kết quả khảo sát in silico gen p16INK4a

........................................................47

III.2.2.1. Thu thập trình tự gen ................................................................................47

III.2.2.2. Thu thập bộ mồi cho phản ứng MSP........................................................48

III.2.2.3. Đánh giá các thông số vật lý của mồi.......................................................49

III.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ................................................54

III.3.1. Thực hiện phản ứng MSP trên gen APC và p16INK4a

..................................54

III.3.2. Giải trình tự mẫu đại diện: ..........................................................................60

Khóa Luận Tốt Nghiệp

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào Trang iv

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................................62

IV.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................62

IV.2. ĐỀ NGHỊ...........................................................................................................63

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................64

PHỤ LỤC.......................................................................................................................79

Khóa Luận Tốt Nghiệp

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào Trang v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AC Adenoma carcinoma

APC Adenomatous polyposis Coli

CDK Cyclin Dependent Kinase

CIN Cervical intraepithelial neoplasia

CIS carcinoma in situ

CK1γ casein kinase 1-γ

DNA Deoxyribonucleic acid

DNMT DNA methyltransferases

FAP Familial adenomatous polyposis

GSK3b Glycogen synthase Kinase 3b

HPV Human Papilloma virus

HSIL High-grade Squamous Intraepithelial Lesions

LSIL Low-grade Squamous Intraepithelial Lesions

MF Methylated forward primer

MR Methylated revesre primer

MSP Methylation-Specific PCR

NCBI National Center for Biotechnology Information

p16INK4a Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 4a

p53 tumor suppressor protein

PCR Polymerase Chain Reaction

Rb retinoblastoma

Khóa Luận Tốt Nghiệp

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào Trang vi

SAM S-denosylmethionine

SCC Squamous cell carcinoma

SIL squamous intraepithelial lesion

Tm Temperature melt

UF Unmethylated forward primer

UR Unmethylated revesre primer

UTCTC Ung thƣ cổ tử cung

WHO World Health Organization

Khóa Luận Tốt Nghiệp

SVTH: Nguyễn Thị Anh Đào Trang vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng II. 1. Thành phần phản ứng PCR..........................................................................25

Bảng III. 1.Tần số methyl hóa gen APC trong các loại ung thƣ. ..................................28

Bảng III. 2. Tần suất methyl hóa gen APC ở các giai đoạn khác nhau trong UTCTC và

phƣơng pháp xác định ....................................................................................................33

Bảng III. 3. Bộ mồi cho phản ứng MSP đối với gen APC............................................36

Bảng III. 4 Kết quả khảo sát mồi MSP đối với gen APC..............................................37

Bảng III. 5. Tần xuất methyl hóa gen p16INK4a trong các loại ung thƣ .........................43

Bảng III. 6.Tần suất methyl hóa gen p16INK4a ở các giai đoạn khác nhau trong UTCTC

và phƣơng pháp xác định ...............................................................................................46

Bảng III. 7. Bộ mồi cho phản ứng MSP đối với gen p16INK4a

......................................48

Bảng III. 8. Kết quả khảo sát mồi MSP đối với gen p16INK4a

.......................................50

Bảng III. 9. Kết quả khảo sát sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen APC..56

Bảng III. 10. Kết quả khảo sát sự methyl hóa đảo CpG trên vùng promoter gen p16INK4a

........................................................................................................................................58

Bảng III. 11. Tính chất methyl hóa trên gen p16INK4a trong trên bộ mẫu bệnh phẩm

nhiễm/không nhiễm HPV...............................................................................................59