Khảo sát mức độ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các nhóm gene có liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung / Lê Huyền Ái Thúy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HOÁ TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỘC

VÙNG PROMOTER CỦA CÁC NHÓM GEN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ

HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Mã số: B2010.32.10

Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP. Hồ Chí Minh, 10/2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

KHẢO SÁT MỨC ĐỘ METHYL HOÁ TẠI CÁC ĐẢO CpG THUỘC

VÙNG PROMOTER CỦA CÁC NHÓM GEN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN SỰ

HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA BỆNH UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

Mã số: B2010.32.10

Xác nhận của cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

TP. Hồ Chí Minh, 10/2011

Thành viên tham gia: ThS. Lê Thị Trúc Linh

CN. Hồ Bảo Khuyên

CN. Tôn Nữ Tùng Kim

Đơn vị phối hợp chính: Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á

CN. Hồ Thị Thanh Thủy

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU

I.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 1

I.1.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và tại Việt Nam 1

I.1.2. Tác nhân gây bệnh 1

I.2. TỔNG QUAN VỀ EPIGENETICS VÀ SỰ METHYL HOÁ DNA 3

I.2.1. Định nghĩa sự methyl hóa DNA 4

I.2.2. Enzyme xúc tác 4

I.2.3. Sự methyl hoá DNA trong ung thư 5

I.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC GEN DAPK, DNMT3L, RARβ, p16INK4a

, DcR1 & 2 7

I.3.1. Gen DAPK (Death-Associated Protein Kinase) 7

I.3.1.1. Cấu trúc và chức năng 7

I.3.1.2. Sự methyl hóa gen DAPK trong ung thư 8

I.3.2. Gen RARβ2 (Retinoic Acid Receptor, beta) 9

I.3.2.1. Cấu trúc và chức năng 9

I.3.2.2. Sự methyl hóa gen RARβ2 trong ung thư 10

I.3.3. Gen DNMT3L (DNA methyltransferase 3-like) 10

I.3.3.1. Cấu trúc và chức năng 11

I.3.3.2. Sự methyl hóa gen DNMT3L trong ung thư 12

I.3.4. Gen p16INK4a 13

I.3.4.1. Cấu trúc và chức năng 13

I.3.4.2. Sự methyl hóa gen p16INK4a trong ung thư 14

I.3.5. Gen DcR1 và DcR2 15

I.3.5.1. Cấu tạo và chức năng 15

I.3.5.2. Sự methyl hóa gen DcR1& DcR2 trong ung thư 16

I.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DÙNG ĐỂ PHÁT HIỆN

SỰ METHYL HÓA DNA

17

I.4.1. Phương pháp MSP 18

I.4.1.1. Nguyên tắc MSP 18

I.4.1.2. Xử lý DNA bằng sodium bisulfite 18

I.4.1.3. Đọc kết quả phản ứng MSP 19

I.4.2. Phương pháp BSP (Bisulfite Sequencing PCR) 19

I.4.3. Phương pháp Q-MSP (Quantitative-MSP) 20

I.5. TÍNH CẤP THIẾT 20

I.6. MỤC TIÊU 21

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

II.1. VẬT LIỆU 23

II.2. PHƯƠNG PHÁP 23

II.2.1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico 24

II.2.1.1. Khai thác dữ liệu 24

II.2.1.2. Khảo sát in silico 25

II.2.2. Thực nghiệm 26

II.2.2.1. Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi trong phản ứng Q-MSP 26

II.2.2.2. Thử nghiệm tách chiết DNA 27

II.2.2.3. Thử nghiệm biến đổi bisulfite DNA bằng phương pháp thủ công 30

II.2.2.4. Phương pháp biến đổi bisulfite DNA sử dụng Epitect bisulfite kit 33

II.2.2.5. Phương pháp MSP trên mẫu bệnh phẩm 34

II.2.2.6. Giải trình tự sản phẩm MSP 36

II..2.2.7. Phương pháp điện di trên gel agarose 36

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

III.1. KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO 38

III.1.1. Khai thác dữ liệu 38

III.1.2. Khảo sát in silico 44

III.1.2.1. Thu nhận trình tự gen, xác định cấu trúc gen và đảo CpG 44

III.1.2.2. Thiết kế - đánh giá mồi 45

III.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 59

III.2.1. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng thực nghiệm Q-MSP sử dụng DNA

chứng

59

III.2.2. Giải trình tự sản phẩm MSP từ DNA chứng 69

III.2.3. Xây dựng quy trình 72

III.2.3.1. So sánh hiệu quả của hai phương pháp tách chiết: Phenol/Chloroform và

i-genomic kit

72

III.2.3.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi methyl và unmethyl trên gen

DcR1, sử dụng DNA chưa biến đổi bisulfite

73

III.2.3.3. Thử nghiệm biến đổi DNA bằng Epitect Bisulfite kit và thực hiện MSP 75

III.2.3.4. Thử nghiệm MSP sử dụng DNA biến đổi bisulfite thủ công 76

III.2.4. Thử nghiệm quy trình trên bệnh phẩm 77

III.2.4.1. Đặc điểm methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen

DAPK, RAR, p16INK4a và DcR1 trong bộ mẫu khảo sát

78

III.2.4.2. Tương quan giữa đặc điểm kiểu type HPV nhiễm và tần số methyl hóa

của các gen DcR1, DAPK, RAR và p16INK4a

86

III.2.4.3. Mức độ phủ của các gen có methyl hóa bất thường trong số các mẫu

khảo sát

86

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

IV.1. KẾT LUẬN 89

IV.2. ĐỀ NGHỊ 89

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ II.1: Tiến trình thực hiện nghiên cứu 24

Sơ đồ II.2: Tiến trình thực nghiệm biến đổi bisulfite DNA thủ công 31

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng II.1: Thành phần phản ứng Q-MSP 26

Bảng II.2: Chu kì nhiệt của phản ứng Q-MSP 27

Bảng II.3: Thành phần phản ứng PCR với các cặp mồi WT1, 2 30

Bảng II.4: Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR với WT1, 2 30

Bảng II.5: Thành phần phản ứng biến đổi DNA bằng sodium bisulfite 32

Bảng II.6: Chu trình nhiệt biến đổi bisulfite DNA sử dụng EpiTect bisulfite Kit 34

Bảng II.7: Thành phần của phản ứng MSP 35

Bảng II.8: Chu kì nhiệt của phản ứng MSP 35

Bảng II.9: Giá trị nhiệt độ nóng chảy của các mồi 36

Bảng III.1: Phương pháp phân tích và nguồn mẫu sử dụng trong 36 khảo sát 39

Bảng III.2: So sánh số liệu tần số methyl hóa của các nghiên cứu khác nhau dựa

trên yếu tố kỹ thuật và yếu tố nguồn mẫu

40

Bảng III.3: Tần số methyl hóa trung bình có trọng số của các gen DAPK, RARβ

và p16 trong ung thư cổ tử cung và trong tế bào bình thường

42

Bảng III.4: Trình tự và các thông số IDT của hệ thống mồi thiết kế cho các gen

DcR1, DcR2, DAPK, DNMT3L, RARβ và p16INK4

49

Bảng III.5: Kết quả kiểm tra trên DNA chứng bằng phương pháp QMSP 59

Bảng III.6: Nồng độ và chất lượng DNA được tách bằng 2 phương pháp i￾genomic Kit và Phenol/Chloroform

71

Bảng III.7: Tổng kết đặc nhiễm nhiễm type HPV, đặc điểm loại mẫu bệnh phẩm

và kết quả MSP của DcR1, DcR2, DAPK, RARβ và p16INK4a cho bộ mẫu khảo sát

81

Bảng III.8: Liên quan giữa nhóm tuổi – nguy cơ bệnh – Tính chất methyl hóa bất

thường

83

Bảng III.9: Tần số methyl hóa của các gene DcR1, DAPK, RARβ và p16INK4a

trong mô ung thư cổ tử cung và dịch phết tế bào âm đạo

84

Bảng III.10: Mối tương quan giữa đặc điểm nhiễm type HPV và tần số methyl

hóa của DcR1, DAPK, RAR, p16INK4a

85

Bảng III.11: Các mẫu có lần lượt không, một, hai, ba, bốn gen bị methyl hóa

trong 31 mẫu bệnh phẩm

86

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình I.1: Sự xâm nhiễm và tiến trình gây ung thư cổ tử cung của virus HPV 3

Hình I.2: Sự bổ sung nhóm –CH3 vào vị trí carbon số 5 của Cytosine thuộc cặp

nucleotide CpG trong DNA nhờ enzyme DNA methyltransferase (DNMT)

5

Hình I.3: Sự methyl hóa bất thường tại đảo CpG thuộc vùng promoter của gen 7

Hình I.4: Phương pháp MSP 18

Hình I.5: Sự chuyển từ Cytosine thành Uracil trong sodium bisulfite 19

Hình I.6: Đọc kết quả MSP 19

Hình III.1: Tần số methyl hóa của các gen DAPK, p16 và RARβ trong ung thư cổ

tử cung và trong tế bào bình thường

43

Hình III.2: Sơ đồ cấu trúc vùng gen DAPK, RAR, p16, DNMT3L, DcR1, DcR2

khảo sát, trình tự đảo CpG sau biến đổi bisulfite và vị trí bắt cặp của các cặp mồi

trong phương pháp MSP

52

Hình III.2.1. Gen DAPK 53

Hình III.2.2. Gen RARβ2 54

Hình III.2.3. Gen p16 55

Hình III.2.4. Gen DNMT3L 56

Hình III.2.5. Gen DcR1 57

Hình III.2.6. Gen DcR2 58

Hình III.3: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi RAR-M và RAR-U

62

Hình III.4: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi p16-M và p16-U

63

Hình III.5: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi DAPK-M và DAPK-U

64

Hình III.6: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi DNMT3L

65

Hình III.7: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi DcR1-M và DcR1-U

66

Hình III.8: Kết quả phân tích phản ứng Q-MSP và điện di trên gel agarose sản

phẩm Q-MSP từ cặp mồi DcR2-M và DcR2-U

67

Hình III.9: Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gen DcR1 69

Hình III.10: Kết quả giải trình tự sản phẩm MSP unmethyl của gen DcR1 70

Hình III.11: Kết quả phân tích di trên gel agarose DNA bộ gen tách chiết bằng i￾genomic kit (ký hiệu A trên hình) và Phenol/Chloroform (ký hiệu B trên hình) từ ba

mẫu sinh thiết mô 01, 02 và 03

72

Hình III.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi WT1: giếng 1, 2: tương ứng với mẫu

bệnh phẩm số 1 và thang chuẩn 100 bp

73

Hình III.13: Kết quả PCR với cặp mồi WT2: giếng 1, 2: tương ứng với mẫu bệnh

phẩm số 1 và thang chuẩn 100 bp

73

Hình III.14: Kết quả điện di sản phẩm MSP: giếng 1, 3, và 5 tương ứng sản phẩm 74

MSP của các mẫu 1, 2 và 3 sử dụng mồi methyl WT3; Giếng 2, 4, và 6 tương

ứng sản phẩm MSP của các mẫu 1, 2 và 3 sử dụng mồi unmethyl WT4; Giếng 7:

sản phẩm MSP của mẫu số 1, sử dụng mồi WT2

Hình III.15: Kết quả điện di sản phẩm MSP với cặp mồi WT3 và WT4 sử dụng

DNA biến đổi thủ công: giếng 1, 2 và 3 tương ứng sản phẩm MSP sử dụng mồi

unmethyl WT4, methyl WT3 và thang chuẩn 100 bp

76

Hình III.16: Kết quả điện di sản phẩm MSP với cặp mồi methyl trên gen DcR2,

trước (A) và sau (B) khắc phục băng ký sinh: ký hiệu mẫu được ghi trên các

giếng, kích thước sản phẩm mong đợi được chỉ ra trên hình; lad: thang chuẩn

100 bp

77

Hình III.17: Phân tích đặc điểm methyl hóa vùng promoter của các gen DcR1,

DAPK, RARβ và p16INK4a trên các mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp MSP

79

Hình III.18: Giải trình tự sản phẩm MSP methyl của gen RARβ 80

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AC Adenoma carcinoma

bp Base pair (cặp base)

BSP Bisulfite Sequencing PCR

CDK Cyclin Dependent Kinase

COBRA Combined Bisulfite Restriction Analysis

DAPK Death-Associated Protein Kinase

DcR Decoy receptor

DNA Deoxyribonucleic acid

DNMT DNA methyltransferase

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

HPV Human Papilloma virus

HSIL High Grade Squamous Intraepithelial Lesions

IDT Integrated DNA Technology

LSIL Low Grade Squamous Intraepithelial Lesions

M Methylated

MBD Methyl-CpG-binding

M-F Methylated forward primer

M-R Methylated reverse primer

MSP Methylation Specific PCR

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase chain reaction

QMSP Quantitative Methylation Specific PCR

RARβ Retinoic Acid Receptor beta

SCC Squamous Cell Carcinoma

Taq Thermus aquaticus

TE Tris-base EDTA

Tm Melting temperature

TNFRSF Tumor necrosis factor receptor superfamily

TRAIL TNF-related apoptosis-including ligand

U Unmethylated

UV Ultra violet

WT Wide type

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Trường Đại học Mở TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: Khảo sát mức độ methyl hoá tại các đảo CpG thuộc vùng

promoter của các nhóm gen có liên quan đến sự hình thành và phát triển của

bệnh ung thư cổ tử cung

- Mã số: B2010.32.10

- Chủ nhiệm: TS. Lê Huyền Ái Thúy

- Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Mở TP.HCM

- Thời gian thực hiện: 18 tháng từ tháng 05/2010 đến tháng 11/2011

2. Mục tiêu: Đưa ra một dữ liệu về sự methyl hóa bất thường của một số gen có

liên quan đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư cổ tử cung ở người

Việt nam.

3. Tính mới và sáng tạo:

- Đây là công trình đầu tiên được thực hiện ở Việt nam về tìm hiểu hiện tượng

“Epigenetics” trên nhóm bệnh nhân ung thư cổ tử cung. Để tìm hiểu thông tin này,

phương pháp Methylation Specific PCR cũng là lần đầu tiên được xây dựng thành

công, cả trên DNA chứng và trên hai nguồn bệnh phẩm: dịch phết tế bào âm đạo

và sinh thiết mô ung thư cổ tử cung. Chính vì vậy, kết quả của đề tài về thông tin

sự methyl hóa bất thường trên cụm bốn gen được khảo sát từ 37 bệnh nhân là

thông tin “epigenetic” đầu tiên ở Việt nam được công bố.

- Để đạt được những kết quả trên, nhóm nghiên cứu đã khai thác hiệu quả thông

tin trên các ngân hàng dữ liệu gen, vận dụng kết hợp các công cụ tin-sinh học mới,

phù hợp để khai thác tốt nhất lượng thông tin di truyền trên từng vùng gen (DNA)

khảo sát. Chính sự kết hợp sáng tạo này đã đưa đến các luận chứng khoa học về

mặt lý thuyết làm tiền đề rất tốt, có đủ độ tin cậy để nhóm nghiên cứu đi tiếp bước

thực nghiệm chứng minh.

4. Kết quả nghiên cứu:

- Đã thiết kế thành công các cặp mồi đặc hiệu cho phương pháp MSP và BSP để

kiểm tra mức độ methyl hóa tại các vị trí CpG trong vùng promoter của các gen

DAPK, DNMT3L, RARβ, DcR1, DcR2 và p16INK4a

- Đã thử nghiệm thành công để chứng minh tính hợp nhất về lý thuyết cũng như

chứng minh tính đặc hiệu của tất cả các bộ mồi trong thực nghiệm, sử dụng các

nguồn DNA chứng.