Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp Enzyme Cellulase từ Bacillus amyloliquefaciens D19 :Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

TÊN ĐỀ TÀI

KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE

TỪ Bacillus amyloliquefaciens D19

Mã số đề tài : 19.2TP08SV

Chủ nhiệm đề tài : NGUYỄN LÊ HIỀN HÒA

Đơn vị thực hiện : VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2020

1

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt

tình và những lời động viên sâu sắc của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè trong suốt

khoảng thời gian thực hiện đề tài.

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công

Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cô của Viện Công nghệ Sinh học –

Thực phẩm, Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế đã hỗ trợ về kinh phí, cơ

sở vật chất và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành đề tài nghiên cứu đúng thời

hạn.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Ngọc Ẩn đã tận tình hướng dẫn,

truyền đạt nhiều kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn giúp em kịp thời giải quyết

vấn đề, động viên em những lúc khó khăn và luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi để em

hoàn thành đề tài nghiên cứu này.

Em xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Tấn Việt và TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh đã

luôn quan tâm, chỉ bảo và luôn sẵn lòng hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện đề

tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể sinh viên làm việc tại Phòng Thí nghiệm

Công nghệ Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã giúp đỡ, san sẻ và

tạo động lực để em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này.

Cảm ơn gia đình đã luôn chia sẻ, hỗ trợ và là nguồn động viên to lớn đối với con

trong suốt thời gian qua.

Tuy đã cố gắng rất nhiều nhưng vì vốn kiến thức, kinh nghiệm của bản thân còn

hạn chế, do đó trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài, em không tránh khỏi

những thiếu sót nên rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô

để em có thể hoàn thiện hơn.

Cuối cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe và gặt hái

được nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống.

Em xin chân thành cảm ơn!

2

PHẦN I: THÔNG TIN CHUNG

I. Thông tin tổng quát

1.1. Tên đề tài: Khảo sát các điều kiện sinh tổng hợp enzyme cellulase từ

Bacillus amyloliquefaciens D19.

1.2. Mã số: 19.2TP08SV

1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài:

TT Họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 Nguyễn Lê Hiền Hòa Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài

2 Nguyễn Trung Hậu Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài

3 Trần Nguyễn Diễm Linh Trường ĐHCN Nghiên cứu đề tài

4 TS. Nguyễn Ngọc Ẩn Trường ĐHCN Cố vấn khoa học

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

1.5. Thời gian thực hiện:

1.5.1. Theo hợp đồng: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 3 năm 2020

1.5.2. Gia hạn: 6 tháng

1.5.3. Thực hiện thực tế: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 9 năm 2020

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu:

- Bổ sung thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nguồn Carbon

- Bổ sung bột đậu nành đối với thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn

Nitrogen

- Thay đổi các ngưỡng nhiệt độ từ 25℃, 30℃, 35℃, 40℃ thành 25℃, 28℃,

37℃, 40℃, 45℃ cho phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm.

- Thành viên Nguyễn Trung Hậu không tham gia đề tài.

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 05 triệu đồng (số tiền bằng chữ:

Năm triệu đồng).

II. Kết quả nghiên cứu:

1. Đặt vấn đề

Cellulose được tổng hợp chủ yếu ở thực vật, là thành phần tạo nên độ cứng cho

vách tế bào. Bên cạnh đó, cellulose còn được tạo ra bởi vi khuẩn (VK), hay còn gọi

3

là Bacterial Cellulose (BC) thông qua quá trình polymer hóa các phân tử glucose

thành chuỗi β-1,4-glucane [1]. Một lượng lớn cellulose được tích lũy hằng ngày

trong đất do các sản phẩm từ thực vật, cành lá hoa quả rụng xuống, cây cối chết đi,

một phần do con người thải ra dưới dạng rác thải nông nghiệp như rơm rạ, rác thải

thực phẩm, rác thải công nghiệp và sinh hoạt như giấy vụn, mùn cưa,… Các chất

thải này nếu không được sử dụng hoặc không được tái chế sẽ gây ô nhiễm môi

trường [2]. Bên cạnh đó, việc phân hủy cellulose bằng các tác nhân lý hóa cần phải

có sự tác động của nhiều loại hóa chất độc hại hoặc điều kiện nhiệt độ và áp suất

cao, mất nhiều thời gian [3, 4].

Cellulase là enzyme được sản xuất chủ yếu bởi vi sinh vật (VSV), có khả năng

xúc tác một cách hiệu quả quá trình phân giải cellulose thành các monosaccharide

"đường đơn" như β-glucose hoặc thành các oligosaccharide và các polysaccharide

ngắn hơn và không tạo ra các phụ phẩm độc hại [5]. Sự phân hủy cellulose có tầm

quan trọng đáng kể về kinh tế, bởi vì nó giúp chuyển hóa thành phần chính cellulose

của thực vật thành sản phẩm dễ tiêu thụ và được sử dụng nhiều trong các phản ứng

hóa học như glucose [6]. Do đó, cellulase được xem là một trong những loại

enyzme được sử dụng phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong thực tế như xử lý

các phế phụ phẩm nông nghiệp, xử lý môi trường, sản xuất nhiên liêu sinh h ̣ oc, ̣ ứng

dung trong các ngành công nghiệp như công nghiệp th ̣ ưc ph ̣ ẩm, làm giấy, may

măc̣ … nhằm gia tăng chất lượng sản phẩm.

Nước ta là nước có nền nông nghiệp truyền thống và đang trong quá trình công

nghiệp hóa, hiện đại hóa, chính vì vậy, để có được một nền kinh tế phát triển bền

vững, vừa gia tăng số lượng và chất lượng sản phẩm trong một số ngành công

nghiệp sản xuất, vừa giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường gây ra bởi lượng

rác thải hữu cơ (đa số có thành phần cellulose) thì việc nghiên cứu sản xuất ra lượng

lớn cellulase là điều tất yếu.

Vi sinh vật là nguồn sản xuất cellulase tiềm năng bởi khả năng sinh sản, phát

triển với tốc độ cực kỳ nhanh và sinh tổng hợp lượng lớn các enzyme có hoạt tính

cao. Bên cạnh đó, Việt Nam lại là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, điều

4

kiện này thích hợp cho sự sinh trưởng của các loài vi sinh vật, từ đó tạo nên một

nguồn nghiên cứu dồi dào về các vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose.

Việc nghiên cứu sản xuất cellulase đã và đang là mối quan tâm của nhiều nhà

khoa học trên thế giới, đặc biệt là từ chủng Bacillus amyloliquefaciens [7-9]. Chính

vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát các điều kiện sinh tổng

hợp cellulase từ Bacillus amyloliquefaciens D19” nhằm đáp ứng các nhu cầu ứng

dụng thực tiễn của enzyme này.

2. Mục tiêu

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào

của Bacillus amyloliquefaciens D19, bao gồm:

- Nguồn Carbon

- Nồng độ Carbon

- Nguồn Nitrogen

- pH ban đầu của môi trường nuôi cấy

- Nhiệt độ nuôi cấy

3. Phương pháp nghiên cứu

3.1 Phương pháp khảo sát sơ bộ khả năng sinh cellulase của vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens D19 được cấy theo phương pháp cấy điểm trên đĩa

thạch LB có bổ sung 0,5% CMC. Chủng này sẽ được nuôi ủ ở 37ºC trong 72 giờ.

Sau 72 giờ, lugol được trải đều trên bề mặt đĩa thạch và quan sát vòng phân giải.

Khả năng sinh tổng hợp cellulase được đánh giá bằng độ lớn của vòng phân giải:

A=D-d

Trong đó:

D: đường kính vòng phân giải (mm)

d: đường kính khuẩn lạc (mm)

Độ lớn của vòng phân giải càng lớn phản ánh hoạt tính enzyme càng mạnh và

ngược lại [10].

3.2 Phương pháp xây dựng đường cong tăng trưởng của vi khuẩn

Giống lưu trữ trong tủ đông được cấy ria trên môi trường LB agar, ủ ở 37ºC

5

trong 48 giờ để kiểm tra độ thuần chủng.

Giống được hoạt hóa bằng cách cho sinh khối một khuẩn lạc vào 5 ml môi

trường LB lỏng, lắc 150 vòng/phút qua đêm ở 37ºC.

Giống đã hoạt hóa được cấy tăng sinh với lượng 5 ml vào trong 50 ml môi

trường LB lỏng có bổ sung 1% CMC, lắc 150 vòng/phút qua đêm ở 37ºC.

Khảo sát đường cong tăng trưởng: cấy 1 ml giống tăng sinh trong 100 ml môi

trường LB lỏng có bổ sung 1% CMC (w/v), lắc 150 vòng/phút. Sau mỗi 2 giờ, xác

định giá trị OD600nm của dịch huyền phù. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần [11].

3.3 Phương pháp khảo sát các điều kiện thích hợp để thu nhận cellulase có hoạt

tính cao nhất

3.3.1 Phương pháp chuẩn bị môi trường

Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Carbon

Ảnh hưởng của các nguồn Carbon lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của

chủng vi khuẩn D19 được khảo sát trên 4 loại nguyên liệu chứa thành phần chính là

cellulose như: rơm, trấu, bã mía, CMC.

Môi trường nuôi cấy cơ bản được sử dụng là LB lỏng có bổ sung 1% CMC

(w/v). Rơm, trấu, bã mía, được sử dụng để thay thế CMC trong các nghiệm thức

khác nhau. Mỗi nguồn Carbon được xay nhuyễn và bổ sung vào môi trường LB

lỏng với tỉ lệ 1% (w/v). Sau khi xác định được nguồn Carbon cho sự sinh tổng hợp

cellulase có hoạt tính cao nhất, nguồn Carbon đó sẽ được sử dụng để tiến hành cho

thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Carbon.

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Carbon

Ảnh hưởng của nồng độ Carbon lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng

vi khuẩn D19 được khảo sát trên Carbon thích hợp được chọn từ thí nghiệm trước

với các giá trị nồng độ khác nhau: 0%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4% (w/v).

Nguồn Carbon được xay nhuyễn và bổ sung vào môi trường LB lỏng với các tỉ

lệ như trên. Nồng độ Carbon thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp cellulase của

chủng D19 sẽ được sử dụng để tiến hành các khảo sát tiếp theo.

Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Nitrogen