Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A bất hoạt qui mô 100.000 liều/năm

bé khoa häc vµ c«ng nghÖ Bé y tÕ

ch−¬ng tr×nh khoa häc vµ c«ng nghÖ

phôc vô ch¨m sãc vµ b¶o vÖ søc kháe céng ®ång

b¸o c¸o tãm t¾t dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm cÊp nhµ n−íc

hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin

viªm gan A bÊt ho¹t qui m« 100.000 liÒu/n¨m

m∙ sè KC.10-DA12

5972

10/8/2006

Hµ néi – 2004

dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm cÊp nhµ n−íc kc.10 – da12

hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt

v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t qui m« 100.000

liÒu/n¨m

Chñ nhiÖm dù ¸n : GS.TSKH NguyÔn Thu V©n

C¸c c¸n bé tham gia

TS.NguyÔn TuyÕt Nga

CNSH.Vò Hång Nga

CN.Lª Hoµng Long

TS.§ç TuÊn §¹t

TS.§ç Thñy Ng©n

TS.NguyÔn QuÕ Anh

PGS.TS.§oµn Huy HËu

PGS.TS.Hå B¸ Do

BS.§inh Hång D−¬ng

C¸c c¬ quan tham gia

C«ng ty v¾c xin vµ sinh phÈm sè 1 - ViÖn VÖ sinh dÞch tÔ Trung

−¬ng

Trung t©m Quèc gia KiÓm ®Þnh v¾c xin vµ c¸c chÕ phÈm sinh häc

Trung t©m khoa häc s¶n xuÊt v¾c xin Sabin

Bé m«n DÞch tÔ - Häc viÖn Qu©n y

c¸c ch÷ viÕt t¾t

ADN Desoxyribonucleic acid

(axÝt desoxyribonucleic)

ARN Ribonucleic acid

(axÝt ribonucleic)

ALT Alanin transferaza

AST Asparagin Transferaza

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng- Mü)

cADN Complementary ADN

(ADN bæ sung)

§¦MD §¸p øng miÔn dÞch

ED50 Effective dose 50

(LiÒu g©y miÔn dÞch 50%)

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

(thö nghiÖm miÔn dÞch g¾n enzym)

ELU ELISA Unit

(§¬n vÞ ELISA)

GMT Geometric mean titer

(hiÖu gi¸ trung b×nh nh©n)

HAV Hepatitis A Virus

(Virót viªm gan A)

HLA kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu ng−êi

HT HuyÕt thanh

IFNβ interferon-β

IFNγ interferon-γ

IFNα interferon-α

kD kilodalton

(kil«dalton)

LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle

mIU mili International unit

(mili ®¬n vÞ quèc tÕ)

µg mcg

M Mol

MSV Master seed virus

(Chñng gèc gièng)

NMWL Nominal Molecular Weight Limit

( KÝch cì giíi h¹n träng l−îng ph©n tö )

nm nanomet

NCR Non coding region

(Vïng kh«ng m· hãa)

ORF Open reading frame

(khung ®äc më)

PCR Polymerase chain reaction

(ph¶n øng chuçi polymeraza)

PFU Plaque Forming Unit

(§¬n vÞ t¹o ®¸m ho¹i tö)

PMMK Primary Monkey Kidney Cell

(TÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t)

rpm round per minute

(Vßng/phót)

SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

(®iÖn di trªn gel polyacrylamid)

TCYTTG Tæ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi

TCID 50 Tissue Culture Infectious Dose 50

(LiÒu g©y nhiÔm 50% tÕ bµo)

VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1

VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng

VX V¾cxin

WSV Working seed virus

( Chñng s¶n xuÊt)

môc lôc

§Æt vÊn ®Ò 1

CH¦¥NG 1 : VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p 2

1.1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t

2

1.2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t 3

1. 2.1. An toµn chung ................................................................................. 3

1. 2.2. KiÓm tra v« khuÈn .................................................................... 3

1.2.3. KiÓm tra chÊt g©y sèt ........................................................................ 3

1.2.4. KiÓm tra chÊt hÊp phô Al(OH)3.......................................................... 4

1.2.5. KiÓm tra hµm l−îng Formaldehyt .................................................... 4

1.2.6. KiÓm tra hµm l−îng protein toµn phÇn ............................................ 4

1.2.7. KiÓm tra c«ng hiÖu .......................................................................... 4

1.3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña

v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t trªn thùc ®Þa l©m sµng 5

1.3.1. §èi t−îng nghiªn cøu………………………………………………. 5

1.3.2. VËt liÖu nghiªn cøu………………………………………………… 5

1.3.3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu…………………………………………… 5

CH¦¥NG 2: KÕt qu¶ vµ bµn luËn 8

2.1. Hoµn thiÖn qui tr×nh s¶n xuÊt v¾c xin viªm gan A bÊt ho¹t 8

2.1.1 HiÖu gi¸ vi rót viªm gan A trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy…………………8

2.1.2. HiÖu gi¸ vi rót viªm gan A trong qu¸ tr×nh tinh khiÕt virót ………...8

2.1.3 Hµm l−îng Protein toµn phÇn ……………......................................... 8

2.1.4. Thö nghiÖm bÊt ho¹t…………………………………………………9

2.1.5. Pha chÕ v¾c xin vµ ®ãng èng………………………………………...9

2.2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t 10

2. 2.1. X©y dùng tiªu chuÈn vÒ thµnh phÇn ho¸ häc…………………….. 10

2.2.2. X©y dùng vÒ c¸c chØ sè sinh häc…………………………………...11

2.3. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm

gan A bÊt ho¹t trªn thùc ®Þa l©m sµng 13

2.3.1. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn cña v¾c xin viªm gan A trªn c¸c ®èi

t−îng……………………………………………………………………… 13

2.3.2. KÕt qu¶ ®¸p øng miÔn dÞch sau tiªm VX ë nhãm ®èi t−îng cã

anti-HAV (-)……………………………………………………………… 14

2.3.3. KÕt qu¶ ®¸p øng miÔn dÞch sau tiªm VX ë nhãm ®èi t−îng cã

anti-HAV (+)…………………………………………………………….. 18

KÕt luËn 20

KiÕn nghÞ 22

Tµi liÖu tham kh¶o 23

1

®Æt vÊn ®Ò

Virót viªm gan A (HAV) lµ rÊt phæ biÕn ë tÊt c¶ c¸c n−íc khu vùc T©y

Th¸i B×nh D−¬ng vµ §«ng Nam ¸. §iÒu kiÖn vÖ sinh kÐm ®· lµm l©y lan

HAV ë nh÷ng vïng dÞch l−u hµnh cao. Møc ®é l−u hµnh cña HAV trong

céng ®ång lµ cùc kú cao. C¸c nghiªn cøu huyÕt thanh-dÞch tÔ häc ë

Bangladesh, Bhutan, India, Maldive vµ Nepal chøng minh r»ng 85-95% trÎ

em ë 10 tuæi ®· cã miÔn dÞch víi HAV. ChØ cã mét sè Ýt trÎ bÞ nhiÔm ph¸t

triÓn thµnh c¸c tr−êng hîp nhiÔm trïng cã triÖu chøng. Nghiªn cøu c¨n

nguyªn c¸c tr−êng hîp viªm gan r¶i r¸c ë c¸c n−íc nµy chøng minh r»ng

nhiÔm HAV chÞu tr¸ch nhiÖm tíi kho¶ng 10-25% tÊt c¶ c¸c tr−êng hîp

viªm gan ë trÎ em, trong khi nhiÔm ë ng−êi lín th−êng chØ lµ 1-5%. DÞch

viªm gan A th−êng xÈy ra ë c¸c thµnh phè cã liªn quan ®Õn viÖc sö dông

nguån n−íc uèng vµ thùc phÈm kh«ng an toµn.

KÕt qu¶ nghiªn cøu huyÕt thanh-dÞch tÔ häc ë Indonesia vµ Th¸i Lan

cho thÊy huyÕt thanh d−¬ng tÝnh ë trÎ em gi¶m xuèng trong n¨m 1994-

1995 (30-35%) so víi kÕt qu¶ nghiªn cøu ®· tiÕn hµnh vµo n¨m 1977-1978

(85-90%) ë trÎ em tuæi tõ 7-12 tuæi. §©y cã thÓ lµ kÕt qu¶ c¶i thiÖn tiªu

chuÈn vÖ sinh, lµm s¹ch m«i tr−êng, thiÕt bÞ n−íc uèng vµ còng do gi¶m

m¹nh sù l−u hµnh cña HAV.

ë ViÖt nam nhiÒu nghiªn cøu vÒ HAV còng ®· ®−îc tiÕn hµnh vµ cho

thÊy HAV lµ nguyªn nh©n chñ yÕu c¸c tr−êng hîp viªm gan cÊp tÝnh

(29%), 59% trong sè ®ã cã ®é tuæi > 20 tuæi. Nh÷ng nghiªn cøu kh¸c cho

thÊy 90% d©n ë n«ng th«n cã anti-HAV (IgG) thuéc tuæi thanh niªn.

T×nh h×nh dÞch tÔ häc HAV ®ang thay ®æi ë nhiÒu n−íc. Víi viÖc t¨ng

c−êng tiªu chuÈn vÖ sinh ë nhiÒu n−íc tû lÖ nhiÔm HAV ë trÎ nhá ®· gi¶m

®i nhiÒu, thËm trÝ c¶ ë nh÷ng n−íc vµ vïng cã dÞch l−u hµnh cao, song c¸c

2

æ dÞch thÊp ®ang xuÊt hiÖn. Do ®ã ë nhiÒu n−íc ®ang chuÈn bÞ ph¶i ®ãn

nhËn c¸c tr−êng hîp viªm gan A l©m sµng ngµy cµng t¨ng ë nh÷ng trÎ lín

h¬n vµ ng−êi lín. MÆc dï ®· cã v¾cxin tèt, song gi¸ thµnh rÊt ®¾t vµ v× vËy

kh«ng cã kh¶ n¨ng tiªm ®¹i trµ ®−îc. C¸c sinh phÈm chÈn ®o¸n viªm gan A

hiÖn nay còng rÊt ®¾t do ®ã còng h¹n chÕ viÖc sö dông ®Ó thö nghiÖm tr−íc

khi tiªm phßng.

§Ò tµi KHCN 11-10 ®· nghiÖm thu xuÊt s¾c, nghiªn cøu x©y dùng ®−îc

c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t tõ nu«i cÊy tÕ bµo thËn khØ

PMMK, ®¶m b¶o yªu cÇu tèi thiÓu cña TCYTTG vÒ lo¹i v¾cxin nµy. HiÖn

nay, tiªu chuÈn ViÖt nam ®Ò ra cho lo¹i v¾cxin nµy vÉn ch−a ®−îc dù th¶o.

Nghiªn cøu hoµn thiÖn quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A

trªn nu«i cÊy tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t PMMK cã nguån cung cÊp dåi dµo

trong n−íc nh»m gi¶m gi¸ thµnh cña v¾cxin lµ yªu cÇu cÊp thiÕt ®−îc ®Æt

ra. MÆt kh¸c hiÖn nay liÒu tiªm vµ lÞch tiªm rÊt kh¸c nhau gi÷a c¸c v¾cxin

viªm gan A ®−îc sö dông còng nh− sù cÇn thiÕt cña liÒu tiªm nh¾c l¹i vÉn

®ang lµ vÊn ®Ò cÇn nghiªn cøu. XuÊt ph¸t tõ nh÷ng yªu cÇu cÊp thiÕt ®ã, dù

¸n “ Hoµn thiÖn quy tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t

quy m« 100.000 liÒu/n¨m” cã môc tiªu nh− sau:

1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt

ho¹t ë qui m« 100.000 liÒu/n¨m ®¹t tiªu chuÈn quèc tÕ.

2. X©y dùng tiªu chuÈn ViÖt nam cho v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t.

3. §¸nh gi¸ hiÖu lùc cña v¾cxin trªn thùc ®Þa l©m sµng, x¸c ®Þnh

lÞch tiªm vµ liÒu tiªm phï hîp.

Víi nh÷ng môc tiªu ®ã, Dù ¸n cã néi dung chÝnh nh− sau :

3

1.Hoµn thiÖn qui tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A bÊt ho¹t tõ

nu«i cÊy tÕ bµo thËn khØ tiªn ph¸t Maccaca mulatta : bæ sung trang thiÕt bÞ

cÇn thiÕt ®Ó më réng s¶n xuÊt; nghiªn cøu vµ x©y dùng ®−îc c¸c th«ng sè

hãa, lý, sinh häc tèi −u; c¶i tiÕn mét sè c«ng ®o¹n trong quy tr×nh s¶n xuÊt

®Ó n©ng cao c«ng suÊt

2. X©y dùng tiªu chuÈn quèc gia thÝch hîp cho v¾cxin viªm gan A

bÊt ho¹t vÒ c¸c thµnh phÇn ho¸ häc (protein, formaldehyt, hydroxyt nh«m,

pH), an toµn, c«ng hiÖu, v« khuÈn, chÝ nhiÖt tè. Nghiªn cøu tÝnh æn ®Þnh vÒ

chÊt l−îng vµ c¸c thµnh phÇn cña c¸c lo¹t v¾cxin viªm gan A do ViÖt nam

s¶n xuÊt so s¸nh víi tiªu chuÈn cña TTYTTG.

3. §¸nh gi¸ hiÖu lùc cña v¾cxin viªm gan A trªn thùc ®Þa l©m sµng

giai ®o¹n III, theo dâi tÝnh an toµn, ph¶n øng phô, ®¸p øng miÔn dÞch trªn

nhãm ng−êi t×nh nguyÖn, ®¸nh gi¸ hiÖu lùc cña v¾cxin viªm gan A víi cì

mÉu n = 300. X¸c ®Þnh liÒu tiªm vµ lÞch tiªm phï hîp cho c¸c ®èi t−îng

kh¸c nhau.

4

Ch−¬ng 1

Tæng quan

1. Nh÷ng hiÓu biÕt hiÖn nay vÒ virót viªm gan A

1.1. LÞch sö virót viªm gan A

Héi chøng vµng da ®· ®−îc m« t¶ trong lÞch sö tõ thÕ kû thø 8. Tuy

nhiªn ®Õn tËn thÕ kû 17, 18 vµ 19 nh÷ng vô dÞch vµng da lín ®· ®−îc m« t¶

®Çy ®ñ h¬n. N¨m 1947, Mac Callum ®· ®−a ra côm tõ viªm gan A vµ viªm

gan B ®Ó ph©n biÖt c¸c lo¹i viªm gan virót. Nh÷ng côm tõ nµy ®· ®−îc Uû

ban Viªm gan virót cña Tæ chøc y tÕ thÕ giíi c«ng nhËn. Virót viªm gan A

®−îc x¸c ®Þnh lÇn ®Çu tiªn b»ng kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö n¨m 1973 nhê

Feinstone. N¨m 1979 Provost vµ Hilleman ®· thµnh c«ng trong nu«i cÊy

virót viªm gan A trªn tÕ bµo, më ®Çu cho nh÷ng nghiªn cøu ph¸t triÓn

v¾cxin.

1.2. §Æc ®iÓm virót viªm gan A

Nh÷ng nghiªn cøu tiÕp sau nµy ®· x¸c ®Þnh ®−îc HAV lµ mét virót

picorna. H¹t virót h×nh cÇu nhá kh«ng cã vá cã ®−êng kÝnh kho¶ng 27-32

nm, tèc ®é l¾ng 156 -160S, vµ c¸c b¨ng xung quanh 1.33 -1,34 g/cm3 trong

CsCl. Gen«m lµ sîi ®¬n ARN th¼ng dµi 7,5 kb víi cùc nhËn biÕt th«ng tin ë

®Çu 5’ vµ ®Çu 3’ lµ mét chuçi poly (A).

Gièng nh− tÊt c¶ c¸c virót picorna kh¸c, genom HAV cã thÓ chia thµnh

3 phÇn : (a) ®Çu 5’ kh«ng m· hãa (NCR) chiÕm kho¶ng 10% genom vµ nèi

víi protein virót VPg ; (b) mét khung ®äc më m· hãa cho tÊt c¶ c¸c protein

5

virót bao gåm P1 cho protein capsit vµ P2,P3 cho protein kh«ng cÊu tróc ;

(c) ®Çu 3’ ng¾n kh«ng m· hãa (NCR). §Çu 5’ NCR lµ vïng æn ®Þnh nhÊt

cña genom HAV (h¬n 89% nucleotit gièng nhau trong 7 chñng ®¹i diÖn

cho genotýp I,II,III. §ét biÕn vïng 5’ NCR lµm t¨ng kh¶ n¨ng thÝch øng

cña HAV trong nu«i cÊy tÕ bµo nh−ng kh«ng ®ãng vai trß quan träng trong

kh¶ n¨ng g©y bÖnh cña virót. §Çu 3’ NCR cã tû lÖ kh¸c biÖt cao gi÷a c¸c

chñng HAV vµ ®ét biÕn (20%). T¸c ®éng cña vïng 3’ vµ 5’ trong tæng hîp

ARN cña picorna virut ch−a ®−îc hiÓu biÕt ®Çy ®ñ nh−ng ®ãng vai trß quan

träng.

Ba protªin cÊu tróc, VP1 - VP3, s¾p xÕp theo kÝch th−íc tõ 24 ®Õn 33

kD ®−îc sao chÐp tõ tr×nh tù axit nucleic cña virót, vµ t−¬ng tù gi÷a tæ

chøc genom cña HAV vµ c¸c picornavirót ®· biÕt kh¸c, song ch−a bao giê

x¸c ®Þnh ®−îc ë viri«n. Ba polypeptit capsit chÝnh ®· ®−îc x¸c ®inh bao

gåm : VP1 (30-33 kD), VP2 (24-27 kD), VP3 (23-29 kD). Träng l−îng

ph©n tö chÝnh x¸c cña polypeptit nhá (VP4) vÉn ch−a ®−îc x¸c ®Þnh. Vïng

quyÕt ®Þnh nguyªn cña protein capsit cã thÓ rÊt bÒn v÷ng trong qu¸ tr×nh

nu«i cÊy l©u dµi. MÆc dï qu¸ tr×nh chÕ biÕn sau phiªn dÞch vµ sè phËn cuèi

cïng cña ®Çu kÕt thóc amino cña polyprotªin biÓu thÞ vÉn ch−a ®−îc x¸c

®Þnh râ rµng, mét ®o¹n tÝn hiÖu cho qóa tr×nh myrin ho¸ ë vÞ trÝ axit amin

thø b¶y sau Methionin thø nhÊt víi mét vïng VP4 ng¾n gi¶ thiÕt r»ng kh¶

n¨ng cã mét ®Çu dÉn peptit t¾t (L).

VP1 lµ mét protein cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng bÒ mÆt chÝnh trong

picornavirut. X¸c ®Þnh tr×nh tù dùa trªn vïng VP1/2A ph©n lo¹i ®−îc 7

genotýp kh¸c nhau. Bèn trong sè c¸c genotýp ®ã cã liªn quan ®Õn kh¶ n¨ng

g©y bÖnh cho ng−êi (I,II,III vµ VII). Genotýp I vµ III ®−îc t×m thÊy phæ

biÕn trong c¸c nghiªn cøu trong khi genotýp II vµ VII mçi lo¹i chØ ®−îc ®¹i

diÖn b»ng mét chñng ph©n lËp. So s¸nh b»ng vïng VP1 cho thÊy 23,7 %

biÕn ®æi ë møc ®é nucleotit vµ 10,5% biÕn ®æi ë møc ®é axit amin gi÷a c¸c

6

chñng ph©n lËp ®−îc. Nghiªn cøu cña Mauro Costa –Mattioli vµ céng sù ®·

t×m thÊy ®ét biÕn trong vïng VP1 víi sù biÕn mÊt cña 15 axit amin cho

thÊy kh¶ n¨ng cña ®ét biÕn trèn tho¸t kh¸ng thÓ trung hßa. Mét nghiªn cøu

kh¸c t×m thÊy ®ét biÕn cña vïng VP1 víi sù biÕn mÊt cña 18 nucleotit cña

chñng HAV thÝch øng trong nu«i cÊy tÕ bµo. Vïng gen m· hãa cho 2A cña

picornavirut ®¹i diÖn cho vïng hay thay ®æi nhÊt trong genom. Trong khi

2A cã chøc n¨ng proteolytic trong entero vµ rhinovirut th× ë c¸c virót kh¸c

kh«ng t×m thÊy tr×nh tù kiÓu proteaza hoÆc ho¹t tÝnh catalytic. CÊu tróc gen

vïng 2A vµ kÝch th−íc vÉn cßn ch−a ®−îc x¸c ®Þnh râ. Mét vµi nghiªn cøu

®· chØ ra r»ng kÝch th−íc cña 2A vµ 2B kh«ng gièng nh− pháng ®o¸n ban

®Çu. ViÖc xãa bá 10 ®Õn 15 axit amin trong protein 2A chØ cã mét t¸c ®éng

rÊt nhá trong nu«i cÊy HAV trªn tÕ bµo vµ gan khØ ®u«i sãc. MÆc dï ®ét

biÕn vïng P2 (protein 2C vµ 2B) cÇn thiÕt cho kh¶ n¨ng thÝch øng cña

chñng HM175 vµ c¸c chñng HAV kh¸c trong nu«i cÊy tÕ bµo, ®ét biÕn cña

vïng 5’ kh«ng dÞch m· còng cã vai trß quan träng .

H×nh 1 : H×nh ¶nh virót viªm gan A d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö

7

HAV v−ît xa poliovirót vÒ æn tÝnh ®Þnh nhiÖt hoµn toµn ë 20o

C , sèng

sãt do nhiÖt tíi 60o

C trong mét thêi gian dµi. Sù æn ®Þnh nhiÖt nµy cho thÊy

cã sù kh¸c biÖt ®¸ng kÓ trong h×nh ¶nh cÊu tróc capsit cña HAV mµ vÉn

ch−a x¸c ®Þnh ®−îc. Gièng nh− c¸c enterovirót vµ cardiovirut, h¹t HAV

tinh khiÕt bÒn v÷ng víi axÝt. HAV tinh khiÕt bÒn v÷ng h¬n HAV kh«ng

tinh khiÕt, gi÷ ®−îc tÝnh g©y nhiÔm trªn 8 giê. HAV bÒn v÷ng víi nhiÖt ®é

60˚C ë pH trung tÝnh trong Ýt nhÊt 60 phót. Virót chØ bÊt ho¹t mét phÇn sau

10 ®Õn 12 giê kh¸c víi c¸c picornavirut kh«ng bÒn v÷ng ë 56˚C. Ho¹t tÝnh

g©y nhiÔm cã thÓ duy tr× Ýt nhÊt 1 th¸ng sau khi ®«ng kh« vµ b¶o qu¶n ë

25˚C víi 42% ®é Èm hoÆc nhiÒu n¨m ë nhiÖt ®é -20˚C hoÆc thÊp h¬n. HAV

kh«ng bÞ bÊt ho¹t bëi chloramin T (1g/l trong 15 phót ë 20˚C) hoÆc

perchloracetic axit. HAV bÞ bÊt ho¹t nhê sÊy −ít (121˚C trong 20 phót), tia

cùc tÝm hoÆc formalin (1 :4000 trong 72 giê ë 37˚C).

Cuèi cïng th× qu¸ tr×nh sao chÐp cña HAV trong tÕ bµo hoµn toµn

kh«ng gièng nh− phÇn lín c¸c picornavirót ®· ®−îc biÕt râ ®Æc tÝnh kh¸c.

ThËm trÝ ë ®iÒu kiÖn tèi −u th× chu tr×nh sao chÐp cña HAV ®−îc thùc hiÖn

vµ kÐo dµi trªn 24 ®Õn 48 giê. Sù sao chÐp cã liªn quan ®Õn hñy ho¹i tÕ bµo

hiÕm khi gÆp trõ khi c¸c chñng virót kh¸c nhau ph¶i ®−îc chän läc mét

c¸ch thËn träng, ë mét vµi hÖ tÕ bµo, vµ víi ®iÒu kiÖn nu«i cÊy ®−îc x¸c

®Þnh chÆt chÏ . Kh«ng cã sù lµm suy sôp sinh tæng hîp ®¹i ph©n tö ë tÕ bµo

chñ. Nh×n chung mét nhiÔm trïng dai d¼ng ®· ®−îc x¸c ®Þnh vµ virót tiÒn

gen cßn l¹i mét l−îng lín trong tÕ bµo.Trong mét vµi tr−êng hîp cã thÓ cÇn

tíi 2 ®Õn 3 tuÇn nu«i cÊy ®Ó ®¹t ®−îc hµm l−îng virót thËm trÝ 100 ®Õn

10.000 lÇn thÊp h¬n, thÝ dô, hµm l−îng poliovirót trong cïng ®iÒu kiÖn nu«i

cÊy tÕ bµo ®Æc hiÖu.

§Æc ®iÓm nh©n lªn cña virót viªm gan A lµ mét trë ng¹i lín trong viÖc

s¶n xuÊt vµ më réng qui m« sö dông v¾cxin viªm gan A. ViÖc nu«i cÊy

HAV rÊt khã ®¹t ®−îc hiÖu suÊt cao hoÆc kh«ng t¹o ra hñy ho¹i tÕ bµo ®Ó

8

cã thÓ quan s¸t ®−îc. B»ng c¸ch sö dông kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang

Provost ®· x¸c ®Þnh ®−îc HAV cÊy truyÒn 31 lÇn trªn khØ ®u«i sãc cã thÓ

nu«i cÊy ®−îc trªn tÕ bµo. Kh¸ng nguyªn virót phÇn lín lµ protein néi bµo.

Thêi gian ®Ó cã ®−îc l−îng kh¸ng nguyªn HAV tèi ®a trong nu«i cÊy tÕ

bµo cã thÓ gi¶m sau khi cÊy truyÒn liªn tiÕp. NhiÒu dßng tÕ bµo tiªn ph¸t vµ

tÕ bµo th−êng trùc cña ®éng vËt linh tr−ëng thÝch hîp cho viÖc nu«i cÊy

HAV, mÆc dï kÕt qu¶ nu«i cÊy phô thuéc vµo chñng virót, lo¹i tÕ bµo vµ

nhiÖt ®é. Dßng tÕ bµo c¶m nhiÔm víi HAV bao gåm tÕ bµo thËn khØ xanh

ch©u Phi tiªn ph¸t vµ thø ph¸t, tÕ bµo thËn khØ cynomologus s¬ sinh, tÕ bµo

thËn khØ Rhesus bµo thai (FRhK-4), tÕ bµo thËn khØ cercopithecus, tÕ bµo

gan Alexander, tÕ bµo mµng èi FL, vµ tÕ bµo l−ìng béi bµo thai ng−êi (WI￾38 vµ MRC-5). TÕ bµo thËn khØ xanh ch©u Phi tiªn ph¸t (AGMK), tÕ bµo

nguyªn bµo sîi cña ng−êi vµ dßng tÕ bµo phæi l−ìng béi ng−êi (MRC5)

th−êng ®−îc sö dông trong s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A. HiÖu gi¸ cña HAV

trong nu«i cÊy tÕ bµo cã thÓ tõ 103 ®Õn 109 TCID50/ml. Thêi gian ®Ó cã

®−îc hiÖu gi¸ virót tèi ®a tõ 2 ngµy cho ®Õn 21 ngµy sau g©y nhiÔm. Tuy

nhiªn sù æn ®Þnh hiÕm thÊy cña virót ë møc ®é cÊu tróc vµ di truyÒn sÏ lµm

dÔ dµng ®i rÊt nhiÒu vÊn ®Ò nµy.

Ba giai ®o¹n nh©n lªn cña virót trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy ®· ®−îc x¸c

®Þnh. Tõ ngµy thø 2 cho ®Õn ngµy thø 8 sau g©y nhiÔm, sîi ARN ©m vµ sîi

d−¬ng cña virót vµ tû lÖ tæng hîp virót HAV cã kh¶ n¨ng l©y nhiÔm ®¹t

møc cao nhÊt. Tõ ngµy thø 9 ®Õn ngµy thø 14, kh¸ng nguyªn virót ®−îc

tæng hîp ë møc cao nhÊt vµ sîi ARN d−¬ng, HAV l©y nhiÔm vÉn ë møc

cao nhÊt nh−ng sîi ARN ©m gi¶m xuèng ë d−íi møc ph¸t hiÖn ®−îc. Sè

l−îng thÊp ARN sîi kÐp ph¸t hiÖn ®−îc ®· chøng minh r»ng cã rÊt Ýt sîi

ARN ©m ®−îc tæng hîp. Sau 14 ngµy, cã rÊt Ýt ho¹t tÝnh qu¸ tr×nh trao ®æi

chÊt cña virót. Cã nhiÒu c¬ chÕ ®· ®−îc ®−a ra ®Ó gi¶i thÝch cho sù sao chÐp