Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắc xin viêm gan B tái tổ hợp

Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ bé y tÕ

Ch−¬ng tr×nh khoa häc vµ c«ng nghÖ

phôc vô ch¨m sãc vµ b¶o vÖ søc khoÎ céng ®ång

B¸o c¸o tãm t¾t Dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm

cÊp nhµ n−íc

Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ

s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B

t¸i tæ hîp

M∙ sè KC.10-DA06

5971

10/8/2006

Hµ Néi-2004

Dù ¸n s¶n xuÊt thö nghiÖm cÊp nhµ n−íc KC.10-DA.06 __________________________________________________________________________________

Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt

v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp

Cè vÊn khoa häc: GS.TSKH. NguyÔn Thu V©n

Chñ nhiÖm dù ¸n: TS.Ng« Thïy Anh

C¸c c¸n bé tham gia: KS. TrÞnh TuÊn ViÖt

Cn. Vò V©n Quúnh

Cn. Vò Hång Nga

Cn. §inh Minh TuÊn

Cn. Qu¸ch Minh Tu©n

Ts. §ç Thñy Ng©n

Ts. Vò Hång C−¬ng

C¸c c¬ quan tham gia:

- C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1- ViÖn VÖ sinh

DÞch tÔ Trung −¬ng

- Trung t©m Quèc gia KiÓm ®Þnh v¾cxin vµ c¸c

chÕ phÈm sinh häc

- Trung t©m y tÕ dù phßng - Thanh Hãa

môc lôc

§Æt vÊn ®Ò...................................................................………………… 1

CH¦¥NG I: VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p ..............................………….. 2

1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B

t¸i tæ hîp.…………………………………………………………….. 2

2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp

s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 3

2.1. An toµn chung ................................................................................. 3

2.2. KiÓm tra v« khuÈn ........................................................................... 3

2.3. X¸c ®Þnh hµm l−îng HBsAg ........................................................... 3

2.4. KiÓm tra chÊt g©y sèt ...................................................................... 4

2.5. KiÓm tra chÊt hÊp phô Al(OH)3 ....................................................... 4

2.6. KiÓm tra hµm l−îng Merthiolat ...................................................... 4

2.7. KiÓm tra hµm l−îng Formaldehyt .................................................... 4

2.8. KiÓm tra hµm l−îng protein toµn phÇn ............................................ 4

2.9. KiÓm tra c«ng hiÖu .......................................................................... 4

2.10. Thö nghiÖm nhËn d¹ng ................................................................. 5

3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña

v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp trªn thùc ®Þa l©m sµng ………………. 5

3.1. §èi t−îng nghiªn cøu……………………………………………… 5

3.2. VËt liÖu nghiªn cøu………………………………………………… 5

3.3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu…………………………………………… 5

CH¦¥NG II : KÕt qu¶ vµ bµn luËn .......................................…..….... 7

1. Hoµn thiÖn quy tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ........... 7

1.1. KÕt qu¶ kiÓm tra chñng s¶n xuÊt KM71-47-1.................................. 7

1.2. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh nh©n lªn cña tÕ bµo nÊm men................ 7

1.3. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh biÕn n¹p................................................. 7

1.4. KiÓm tra vì tÕ bµo............................................................................ 8

1.5. KiÓm tra qu¸ tr×nh tinh chÕ HBsAg.................................................. 8

1.6. Pha chÕ v¾cxin vµ ®ãng èng………………………………………. 12

2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp

s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 12

2.1. X©y dùng tiªu chuÈn vÒ thµnh phÇn ho¸ häc……………………….. 12

2.2. X©y dùng vÒ c¸c chØ sè sinh häc……………………………………. 13

3. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin

viªm gan B t¸i tæ hîp RecomBvax trªn thùc ®Þa l©m sµng ................ 14

3.1. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn……………………………………… 14

3.2. C¸c kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ vÒ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch

sau khi tiªm v¾cxin theo ph¸c ®å th¸ng 0-1-2…………………….. 15

Ch−¬ng III. KÕt luËn.............................................................……........ 18

Tµi liÖu tham kh¶o ..................................................................……….. 21

môc lôc

§Æt vÊn ®Ò...................................................................………………. 1

Ch−¬ng I: Tæng quan ..................................................................… 3

1. Nh÷ng hiÓu biÕt hiÖn nay vÒ virót viªm gan B.............................… 3

1.1. Th«ng tin ®¹i c−¬ng vÒ virót viªm gan B ........................................ 3

1.2. LÞch sö virót viªm gan B ................................................................. 3

1.3. CÊu tróc sinh häc ph©n tö cña virót B…………………………….. 4

1.4. BÖnh lý häc ...................................................................................... 12

1.5. DÞch tÔ häc virót viªm gan B ......................................................... 12

1.6. ChÈn ®o¸n viªm gan B .................................................................... 13

1.7. C¸c thÓ l©m sµng .............................................................................. 14

1.8. §iÒu trÞ .......................................................................................... 15

1.9. Dù phßng ....................................................................................... 16

1.10. ChiÕn l−îc lo¹i trõ l©y truyÒn viªm gan virót B ...............….......... 17

1.11. Phßng nhiÔm virót viªm gan B ...................................................... 18

1.12. Globulin miÔn dÞch phßng viªm gan B (HBIG).............................. 18

2. C¸c lo¹i v¾cxin viªm gan B vµ nh÷ng nghiªn cøu vÒ v¾cxin

viªm gan B hiÖn nay………………………………………………… 18

2.1. C¸c lo¹i v¾cxin phßng viªm gan B vµ xu h−íng ph¸t triÓn………. 18

2.2. TÝnh an toµn cña v¾cxin viªm gan B……………………………… 20

2.3. TÝnh sinh miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B……………………… 21

2.4. C¸c yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn tÝnh sinh miÔn dÞch cña

v¾cxin phßng viªm gan B………………………………………… 23

3. Sö dông c«ng nghÖ t¸i tæ hîp ADN ®Ó biÓu thÞ kh¸ng nguyªn ....... 26

3.1. C¸c hÖ biÓu thÞ kh¸c nhau .............................................................. 26

3.2. BiÓu thÞ ë nÊm men ........................................................................ 26

3.3. BiÓu thÞ ë tÕ bµo ®éng vËt .............................................................. 27

3.4. HÖ biÓu thÞ ë Pichia pastoris .......................................................... 27

CH¦¥NG II: VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p ..............................… 31

1. Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B

t¸i tæ hîp.…………………………………………………………….. 31

1.1. Chñng s¶n xuÊt ................................................................................ 31

1.2. M«i tr−êng ………………………………………………………. 31

1.3. CÊy chñng ………………………………………………………… 33

1.4. Nh©n chñng ………………………………………………………. 33

1.5. BiÕn n¹p néi bµo …………………………………………………. 33

1.6. GÆt tÕ bµo………………………………………………………….. 34

1.7. T¸ch chiÕt HBsAg…………………………………………………. 34

1.8. Tinh chÕ HBsAg…………………………………………………… 34

1.9. BÊt ho¹t virót………………………………………………………. 35

1.10. Pha chÕ v¾cxin……………………………………………………. 35

1.11. So s¸nh qui tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ®· ®−îc

hoµn thiÖn víi qui tr×nh s¶n xuÊt ë qui m« phßng thÝ nghiÖm …… 35

2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp

s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 37

2.1. An toµn chung ................................................................................. 37

2.2. KiÓm tra v« khuÈn ........................................................................... 37

2.3. X¸c ®Þnh hµm l−îng HBsAg ........................................................... 38

2.4. KiÓm tra chÊt g©y sèt ...................................................................... 38

2.5. KiÓm tra chÊt hÊp phô Al(OH)3 ....................................................... 38

2.6. KiÓm tra hµm l−îng Merthiolat ...................................................... 39

2.7. KiÓm tra hµm l−îng Formaldehyt .................................................... 39

2.8. KiÓm tra hµm l−îng protein toµn phÇn ............................................ 40

2.9. KiÓm tra c«ng hiÖu .......................................................................... 40

2.10. Thö nghiÖm nhËn d¹ng ................................................................. 40

3. Ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña

v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp trªn thùc ®Þa l©m sµng ………………. 40

3.1. §èi t−îng nghiªn cøu……………………………………………… 40

3.2. VËt liÖu nghiªn cøu………………………………………………… 41

3.3. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu…………………………………………… 41

CH¦¥NG III: KÕT QU¶ Vµ bµn luËn ............................................ 46

1. Hoµn thiÖn quy tr×nh s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ........... 46

1.1. KÕt qu¶ kiÓm tra chñng s¶n xuÊt KM71-47-1.................................. 46

1.2. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh nh©n lªn cña tÕ bµo nÊm men................ 46

1.3. KÕt qu¶ kiÓm tra qu¸ tr×nh biÕn n¹p................................................. 48

1.4. KiÓm tra vì tÕ bµo............................................................................ 50

1.5. KiÓm tra qu¸ tr×nh tinh chÕ HBsAg.................................................. 50

1.6. Pha chÕ v¾cxin vµ ®ãng èng………………………………………. 58

2. X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp

s¶n xuÊt t¹i ViÖt Nam…………………………………………………. 59

2.1. X©y dùng tiªu chuÈn vÒ thµnh phÇn ho¸ häc……………………….. 59

2.2. X©y dùng vÒ c¸c chØ sè sinh häc……………………………………. 64

3. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin

viªm gan B t¸i tæ hîp RecomBvax trªn thùc ®Þa l©m sµng ................ 68

3.1. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ tÝnh an toµn……………………………………… 68

3.2. C¸c kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ vÒ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch

sau khi tiªm v¾cxin theo ph¸c ®å th¸ng 0-1-2…………………….. 74

Ch−¬ng IV. KÕt luËn....................................................................... 78

Tµi liÖu tham kh¶o ...................................................................... 81

c¸c ch÷ viÕt t¾t

aa Amino acid

(axÝt amin)

ADN Desoxyribonucleic acid

(axÝt desoxyribonucleic)

ARN Ribonucleic acid

(axÝt ribonucleic)

AH Aluminium hydroxide

(nh«m hydroxit)

Anti-HBc Antibody against Hepatitis B core antigen

(kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn lâi virót viªm gan B)

Anti-HBe Antibody against Hepatitis B e antigen

(kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn e virót viªm gan B)

Anti-HBs Antibody against Hepatitis B surface antigen

(kh¸ng thÓ kh¸ng kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B)

Au Australia antigen

(kh¸ng nguyªn Australia)

CHO Chinese hamster ovary

(tÕ bµo trøng chuét ®Êt vµng)

CTTCMR Ch−¬ng Tr×nh Tiªm Chñng Më Réng

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt vµ dù phßng- Mü)

D Dalton

DR Double repeat

(lÆp l¹i kÐp)

§¦MD §¸p øng miÔn dÞch

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

(thö nghiÖm miÔn dÞch g¾n enzym)

FDA Food and Drug Administration

(c¬ quan qu¶n lý thuèc vµ thùc phÈm)

GMP Good manufacturing practice

(thùc hµnh s¶n xuÊt tèt)

GMT Geometric mean titer

(hiÖu gi¸ trung b×nh nh©n)

GP Glycoprotein

(glycoprotein)

HBV Hepatitis B virus

(virót viªm gan B)

HBcAg Hepatitis B core antigen

(kh¸ng nguyªn lâi virót viªm gan B)

HBeAg Hepatitis B e antigen

(kh¸ng nguyªn e virót viªm gan B)

HBsAg Hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt virót viªm gan B)

HBx Hepatitis B x antigen

(kh¸ng nguyªn x virót viªm gan B)

HBIg Hepatitis B immunoglobulin

(globulin miÔn dÞch phßng viªm gan B)

HLKN Hµm l−îng kh¸ng nguyªn

HT HuyÕt thanh

HT1 (n) HuyÕt thanh lÊy lÇn thø nhÊt (hoÆc lÇn thø n)

HLA kh¸ng nguyªn b¹ch cÇu ng−êi

IU International unit

(®¬n vÞ quèc tÕ)

IFNβ interferon-β

IFNγ interferon-γ

IFNα interferon-α

kb kilobase

(kil«baz¬)

kD kilodalton

(kil«dalton)

KN Kh¸ng nguyªn

KT Kh¸ng thÓ

LD50 Lethal dose 50%

(liÒu g©y chÕt 50%)

LHBs Large hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i lín)

LH3E Lactalbumin hydrolysate Egle

MHBs Medium hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i trung b×nh)

MLD Minimal lethal dose

(liÒu g©y chÕt tèi thiÓu)

MSV Master seed virus

(Chñng gèc gièng)

NMWL Nominal Molecular Weight Limit

( KÝch cì giíi h¹n träng l−îng ph©n tö )

OD Optical density

(mËt ®é quang)

ORF Open reading frame

(khung ®äc më)

P Protein

PCR Polymerase chain reaction

(ph¶n øng chuçi polymeraza)

ptl Ph©n tö l−îng

SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

(®iÖn di trªn gel polyacrylamid)

SD Standard deviation

(®é lÖch chuÈn)

SHBs Small hepatitis B surface antigen

(kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña virót viªm gan B lo¹i nhá)

TCYTTG Tæ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi

TCVN Tiªu chuÈn ViÖt Nam

VABIOTECH C«ng ty v¾cxin vµ sinh phÈm sè 1

v® võa ®ñ

v/p vßng/phót

VSDTT¦ VÖ Sinh DÞch TÔ Trung ¦¬ng

WSV Working seed virus

( Chñng s¶n xuÊt)

1

®Æt vÊn ®Ò

ViÖt Nam lµ mét trong nh÷ng n−íc cã tû lÖ ng−êi mang HBsAg cao trong

céng ®ång, theo c¸c b¸o c¸o cña c¸c t¸c gi¶ kh¸c nhau cã thÓ giao ®éng tõ 11%-

26%. HBV vÉn chiÕm mét tû lÖ lín trong c¸c c¨n nguyªn g©y viªm gan ë c¸c

bÖnh nh©n bÞ viªm gan, trªn 40% cã c¨n nguyªn g©y bÖnh lµ HBV. HBV còng

chÞu tr¸ch nhiÖm tíi 90% c¸c tr−êng hîp ung th− gan nguyªn ph¸t, trong khi ë

c¸c n−íc ®· tiÕn hµnh tiªm phßng v¾cxin viªm gan B cho céng ®ång tõ nh÷ng

n¨m ®Çu thËp niªn 80 th× c¨n nguyªn chñ yÕu g©y ung th− gan nguyªn ph¸t hiÖn

nay l¹i lµ virót viªm gan C, khi tû lÖ ng−êi mang HBsAg ®· gi¶m xuèng d−íi 1%

do kÕt qu¶ tiªm phßng viªm gan B. Tû lÖ ng−êi mang ë phô n÷ cã thai lµ kho¶ng

12%, trong ®ã nÕu mÑ chØ bÞ HBsAg d−¬ng tÝnh kh«ng th«i th× kh¶ n¨ng truyÒn

sang cho con trong thêi kú chu sinh lµ kho¶ng 40%, vµ nÕu mÑ mang c¶ HBsAg

vµ HBeAg d−¬ng tÝnh th× kh¶ n¨ng truyÒn cho con sÏ lµ kho¶ng > 90%.

Ng−êi mang HBV m¹n tÝnh cã nguy c¬ cao bÞ bÖnh gan trÇm träng khi

tr−ëng thµnh, bao gåm ung th− gan vµ x¬ gan. Tö vong vµ bÖnh g©y ra bëi bÖnh

gan m¹n tÝnh lµ rÊt phæ biÕn. Còng rÊt khã cã thÓ nãi ®−îc bÖnh nµo lµ do HBV

g©y ra v× t×nh tr¹ng bÖnh th−êng kh«ng ®−îc b¸o c¸o ®Çy ®ñ. Tuy nhiªn râ rµng

lµ nhiÔm HBV lµ mét vÊn ®Ò y tÕ céng ®ång quan träng vµ cã thÓ dù phßng ®−îc.

N¨m 1991, nhãm Cè vÊn toµn cÇu cña Ch−¬ng tr×nh tiªm chñng më réng

®· kªu gäi tÊt c¶ c¸c n−íc ®−a thªm v¾cxin viªm gan B vµo Ch−¬ng tr×nh tiªm

chñng quèc gia. ë ViÖt Nam, chÝnh phñ ®· cho phÐp ®−a v¾cxin viªm gan B vµo

Ch−¬ng tr×nh tiªm chñng më réng ®Ó tiªm cho trÎ em d−íi 1 tuæi tõ th¸ng 8 n¨m

1997. Bªn c¹nh v¾cxin viªm gan B s¶n xuÊt tõ huyÕt t−¬ng ng−êi mang HBsAg

cao, viÖc øng dông tiÕn bé khoa häc kü thuËt trong lÜnh vùc c«ng nghÖ sinh häc

®Ó cã ®−îc mét v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp ADN lµ hÕt søc cÇn thiÕt nh»m ®¸p

øng nhu cÇu sö dông v¾cxin ngµy cµng lín trong nh©n d©n.

Dùa trªn kÕt qu¶ ®¸ng khÝch lÖ cña ®Ò tµi KHCN-11-10A (1999) vµ

KHCN-11-10B (2002): “Nghiªn cøu tiÕp thu chuyÓn nh−îng kü thuËt ®Ó x©y

dùng qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan A vµ v¾cxin viªm gan B t¸i tæ

hîp ADN”, v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp (RecomBvax) do C«ng ty V¾cxin vµ

Sinh phÈm sè 1- ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng s¶n xuÊt cã kh¶ n¨ng phôc vô

réng r·i cho nhu cÇu phßng bÖnh. ViÖc bæ sung trang thiÕt bÞ ®Ó më réng s¶n

xuÊt, hoµn thiÖn qui tr×nh, ®µo t¹o c¸n bé KHCN n¾m v÷ng kiÕn thøc vµ kü thuËt

®Ó øng dông ®−îc c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin lµ hÕt søc cÇn thiÕt. Do ®ã, dù ¸n

“Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp” cã môc

tiªu nh− sau:

- Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp.

2

- X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i

ViÖt Nam.

- ChuÈn bÞ n¨ng lùc khoa häc c«ng nghÖ ®Ó tiÕp thu dù ¸n vay vèn cña Hµn

Quèc víi c«ng suÊt 20 triÖu liÒu/n¨m.

Néi dung chÝnh cña dù ¸n lµ :

- Hoµn thiÖn qui tr×nh c«ng nghÖ s¶n xuÊt v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp.

- X©y dùng tiªu chuÈn Quèc gia cho v¾cxin viªm gan B t¸i tæ hîp s¶n xuÊt t¹i

ViÖt Nam.

- §¸nh gi¸ tÝnh an toµn vµ kh¶ n¨ng ®¸p øng miÔn dÞch cña v¾cxin viªm gan B

t¸i tæ hîp trªn thùc ®Þa ë giai ®o¹n 3, víi cì mÉu n=300.

- §µo t¹o ®éi ngò c¸n bé khoa häc, c«ng nh©n kü thuËt lµnh nghÒ n¾m v÷ng

kiÕn thøc vµ kü thuËt ®Ó cã thÓ tiÕp nhËn ®−îc c«ng nghÖ vµ sö dông trang thiÕt

bÞ trong dù ¸n vay vèn cña Hµn Quèc.