Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật

Bài 13 Giới thiệu một số kỹ thuật bảo quản vi sinh vật

1. Phiếu thông tin về chủng vi sinh vật bảo quản:

Đại học Quốc gia Hà Nội

Trung tâm Công nghệ Sinh học

Bảo tàng Giống chuẩn vi sinh vật (VTCC)

Thông tin chung về

chủng vi sinh vật bảo quản

1. Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn

2. Tên khoa học:

Giống (Genus) Loài (Species) Dưới loài (Subspecies)

Tên khác nếu có (synnonym):

3. Nguồn phân lập:

Nơi phân lập:

4. Thời gian bắt đầu bảo quản tại VTCC:

5. Người phân lập:

6. Người cung cấp: Nơi cung cấp:

7. Ký hiệu chủng VTCC:

8. Ký hiệu là lý lịch chủng từ các bảo tàng khác:

VTCC < < < < <

9. Chủng chuẩn (Type) Chủng tự nhiên (wild) Đột biến (cụ thể…)

10. Hình thức sinh sản:

11. Gây bệnh cho: Người Động vật Thực vật Không

12. Dấu chuẩn di truyền (nếu có):

13. Hình thái tế bào, khuẩn lạc:

14. Khả năng ứng dụng:

15. Tài liệu liên quan:

16. Các phương pháp bảo quản:

Đông khô Lạnh sâu Nitơ lỏng Cấy truyền

17. Môi trường nuôi cấy thích hợp:

18. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp:

19. Ghi chú:

2. Chức năng của bộ sưu tập vi sinh vật:

Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và

ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường.

Nhiệm vụ quan trọng nhất của Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là thu thập, làm giàu các chủng vi

sinh vật hữu ích và bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp. Việc thu thập các chủng vi sinh vật

có thể bằng nhiều cách như phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi trong nước và quốc tế. Các

chủng vi sinh vật phải được định hướng theo từng mục tiêu cụ thể của từng Bộ sưu tập, ví dụ các

chủng vi sinh vật chuẩn, các chủng có hoạt tính sinh học và các chủng làm cơ sở cho tra cứu khi

nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật.

Bảo quản các chủng vi sinh vật là công việc không dễ dàng, xuất phát từ mục đích của bảo quản

không những là duy trì khả năng sống của vi sinh vật, thuần chủng, tránh tạp nhiễm mà còn đảm bảo

tính ổn định di truyền và các đặc tính sinh học trong suốt quá trình bảo quản. Thực tế không có một

phương pháp bảo quản nào là vạn năng dùng chung cho các nhóm vi sinh vật mà mỗi nhóm vi sinh

vật chỉ thích hợp với một vài phương pháp bảo quản nhất định.

Các chủng vi sinh vật bảo quản sẽ được cung cấp cho người sử dụng do đó nhiệm vụ quan trọng

của bộ sưu tập vi sinh vật là thu thập và cung cấp các thông tin quan trọng của chủng vi sinh vật bảo

quản cho người sử dụng như: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh

học, tên phân loại v.v..Như vậy yêu cầu đối với cán bộ phụ trách Bộ sưu tập vi sinh vật phải có kiến

thức vững về vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật và bệnh học vi sinh vật để

kiểm soát được các đặc tính quan trọng của các vi sinh vật bảo quản.

3. Một số điểm lưu ý đối với một Bộ sưu tập vi sinh vật:

3.1. Duy trì khả năng sống của vi sinh vật bảo quản:

Trong khi thực hiện các phương pháp bảo quản và trong quá trình bảo quản các tế bào vi sinh

vật sẽ bị chết do đó phải áp dụng phương pháp bảo quản thích hợp nhằm hạn chế thấp nhất khả năng

chết của tế bào.

3.2. Quan tâm đến số lượng tế bào khi tiến hành bảo quản:

Trong quá trình bảo quản thì số lượng tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời gian do vậy cần tính

toán số lượng vi sinh vật tại thời điểm bảo quản thích hợp để duy trì số lượng vi sinh vật sống trong

thời gian bảo quản dài.

3.3. Duy trì đặc tính di truyền ổn định của chủng vi sinh vật

bảo quản:

Nói chung với các chủng vi sinh vật bảo quản, đặc biệt với các chủng vi sinh vật chuẩn, các

chủng vi sinh vật có ứng dụng trong công nghiệp thì yêu cầu duy trì đặc tính sinh học, tính trạng di

truyền là rất quan trọng. Các phương pháp bảo quản không thích hợp có thể dẫn đến đột biến hoặc

mất plasmid. Vì vậy cần phải chọn các phương pháp bảo quản thích hợp cho các chủng này.

3.4. Tính thuần chủng của vi sinh vật bảo quản:

Chủng vi sinh vật từ khi bảo quản đến khi sử dụng phải đảm bảo thuần chủng đúng theo tên và

các đặc điểm sinh học đặc trưng. Đây cũng là yêu cầu tiên quyết đối với công việc của một Bảo tàng

vi sinh vật, do vậy mà các thao tác và phương pháp tiến hành phải được thực hiện sao cho hạn chế tới

mức tối thiểu đối với các chủng bảo quản nhằm tránh tạp nhiễm.

3.5. Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật:

Kinh phí bao gồm kinh phí về lương cho cán bộ, thiết bị, vật tư hoá chất, nhà xưởng và điện

nước tiêu hao. Các kinh phí này tuỳ thuộc vào quy mô của Bộ sưu tập giống vi sinh vật và phương

pháp bảo quản, phạm vi dịch vụ thực hiện đối với khách hàng.

Tên Bảo tàng vi

sinh vật (viết tắt) Nước Số lượng chủng vi sinh vật

ATCC Mỹ 73507

DSMZ Đức 14460

NBRC Nhật 18300

Bảng 1. Quy mô của một số bộ sưu tập giống vi sinh vật.

STT Tên Bảo tàng vi sinh vật, Nước Giá thành (USD)

1 ATCC, Mỹ 80

2 CBS, Hà Lan 60

3 VKM, Nga 45

4 Thái Lan 40

Bảng 2. Giá thành cho bảo quản mỗi chủng vi sinh vật hàng năm

3.6. Bảo quản các chủng có giá trị:

Đối với các chủng vi sinh vật có giá trị thì tuỳ theo yêu cầu mà cần thực hiện nhiều phương

pháp khác nhau cũng như bảo quản tại các nơi khác nhau để hạn chế khả năng mất các đặc tính quý

cũng như mất chủng do những rủi ro ngẫu nhiên (cháy nổ, động đất, chiến tranh v.v..).

3.7. Cung cấp chủng giống cho khách hàng:

Đối với các chủng cần cung cấp nhiều cho khách hàng (hoặc các chủng cần cho nghiên cứu

thường xuyên) thì cần phải bảo quản với số lượng lớn với phương pháp thích hợp cho việc vận

chuyển đến khách hàng.

3.8. Cung cấp các thông tin liên quan đến chủng bảo quản:

Chất lượng của Bộ sưu tập giống liên quan đến các số liệu, thông tin về từng chủng vi sinh vật

bảo quản. Do đó, nhu cầu nghiên cứu để thu nhận các thông tin cần thiết cung cấp cho khách hàng là

rất quan trọng.

3.9. Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản:

Các chủng của Bộ sưu tập vi sinh vật cần phải tuân theo các qui định nghiêm ngặt kiểm tra định

kỳ theo từng thời gian bảo quản như tỷ lệ sống sót, mức tạp nhiễm, thay đổi đặc tính di truyền như

dấu chuẩn di truyền, sự tồn tại của plasmid, đặc điểm phân loại, khả năng sinh các chất có hoạt tính

sinh học…Một trong các cách đánh giá khả năng sống sót của chủng vi sinh vật bảo quản là dựa theo

phương trình sau:

t = 8Log(So/Log So-Log Sac)

Trong đó: t - Thời gian của mẫu bảo quản trong ampoule.

So - Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi bảo quản.

Sac - Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi tiến hành thí nghiệm.

3.10. Cơ sở dữ liệu của Bộ sưu tập vi sinh vật:

Ngày nay, khi tin học là lĩnh vực xâm nhập và làm thay đổi sâu sắc đến mọi lĩnh vực đời sống

thì việc quản lý Bộ sưu tập vi sinh vật không còn là một ngoại lệ. Người ta đã ứng dụng các phần

mềm máy tính phù hợp để quản lý các chủng vi sinh vật bảo quản, các thông tin liên quan cũng như

chương trình kiểm tra chất lượng định kỳ. Sử dụng tin học là công việc có tiện ích lớn, nó giúp cho

người quản lý nắm bắt được toàn bộ thông tin cũng như lý lịch của các chủng vi sinh vật và dễ dàng

tra cứu, làm báo cáo khoa học theo các tiêu chí riêng. Nói chung với các bộ sưu tập có số lượng vi

sinh vật không lớn thì có thể sử dụng phần mềm: Microsoft Access, Access Visual Basic.

4. Giới thiệu chung về một số phương pháp bảo quản vi sinh

vật:

Trong phần này chúng tôi mô tả các phương pháp được dùng chung cho các đối tượng vi sinh

vật chính (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo).

4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật:

Hình 1. Bảo quản bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích

hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho

vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ

thích hợp. Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn

được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp

với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi, Coliform... có thể sống được vài năm theo cách

này. Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và

sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu. Tuy nhiên, phương

pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:

- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc.

- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản.

- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản.

- Tốn nhiều công sức để cấy truyền.

- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp.

- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện

sau mỗi lần cấy truyền.

* Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản:

Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này

các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau:

a. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể

sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học.

Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo

quản nấm men, nấm sợi.