Giáo trình-Nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản-chương 4 ppsx

CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ

IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) do Karl Mullis và

cộng sự phát minh năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp tạo dòng DNA in vitro

không cần có sự hiện diện của tế bào.

IV.1.1. Nguyên tắc

Tất cả các DNA polymeraza khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn

đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả

năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymeraza sẽ nối dài mồi

để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một

trình tự DNA thì chỉ đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một

mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen.

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn

sau (hình 4.1):

IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation):

Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử

DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở

94-95 ºC trong vòng 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn.

IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization):

Nhiệt độ dược hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong

thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-70 ºC tùy thuộc Tm của các mồi sử

dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1phút. Đây là giai đoạn

quyết định tính đặc hiệu của phản ứng.

IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):

Nhiệt độ được tăng lên đến 72 ºC. Đó là điều kiện tốt nhất để cho Taq polymeraza hoạt

động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ 2 đầu sợi khuôn ban đầu giúp

cho DNA polymeraza hoạt động. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần

khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Theo Geifand và White (1990), tốc

độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotit/giây ở nhiệt độ 75o

C - 80o

C; 60 nucleotit/giây ở

70o

C; 24 nucleotit/giây ở 55o

C; 1,5 nucleotit/giây ở 37o

C và ở nhiệt độ 22o

C chỉ còn 0,25

nucleotit/giây.

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tử DNA khuôn được nhân lên

thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân trong chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân

bản tiếp theo vì hai đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó sau mỗi chu kỳ

số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản

48