Định danh một số loài ốc cối (conus spp ) ở cùng biển nam trung bộ việt nam dựa trên đặc điểm hình

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài tại trường Đại học Nha Trang

em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các

thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô giáo và cán bộ trong Viện Công Nghệ Sinh Học

và Môi Trường đã truyền những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong

những năm học vừa qua.

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Đặng Thúy Bình và Th.S Khúc Thị An

đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành

đề tài tốt nghiệp này.

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia

đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt

quá trình thực hiện đề tài.

Mặc dù đã có nhiều cố gắng hoàn thiện đề tài của mình, tuy nhiên không thể

tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của quý

thầy cô và các bạn.

Nha Trang, tháng 6 năm 2011

Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy Hà

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG...............................................................................v

DANH MỤC CÁC HÌNH...............................................................................vi

LỜI NÓI ĐẦU .................................................................................................1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (Conus spp.).............3

I. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG...........3

I.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI ........3

I.1.1. Hệ thống phân loại của ốc cối (Conus spp.)..............................................3

I.1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố..................................................................3

I.1.3. Đặc điểm hình thái ngoài của ốc cối .........................................................5

I.1.4. Cấu tạo bên trong của ốc cối.....................................................................8

I.1.5. Chế độ ăn và phương thức săn mồi...........................................................9

I.1.6. Đặc điểm sinh sản của ốc cối..................................................................12

I.2. NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI .............................................13

I.2.1. Cấu tạo bộ máy sinh độc tố (envenomation apparatus) ...........................13

I.2.2. Phân loại độc tố conotoxin .....................................................................17

I.2.3. Cơ chế tác động của độc tố ốc cối..........................................................21

I.2.4. Ứng dụng y học của độc tố ốc cối............................................................21

I.3. NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VỀ ỐC CỐ .................................................23

I.3.1. Hệ gen cơ quan tử...................................................................................23

I.3.2. Giới thiệu về hệ gen ty thể và hệ gen ribosom ........................................23

1.3.3. Tình hình nghiên cứu di truyền ốc cối....................................................28

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........33

ii

II.1. PHƯƠNG PHÁP, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 33

II.2. MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI ...........................................................34

II.3. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ỐC CỐI........................37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN....................43

III.1. MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI..........................................................43

III.1.1. Conus marmoreus Linnaeus, 1758 .......................................................43

III.1.1.1. Đặc điểm hình thái............................................................................43

III.1.1.2. Tập tính sống ....................................................................................44

III.1.1.3. Phân bố.............................................................................................45

III.1.1.4. Nhận xét ...........................................................................................45

III.1.2. Conus bandanus BRUGUIÈRE, 1792..................................................45

III.1.2.1. Đặc điểm về hình thái .......................................................................45

III.1.2.2. Tập tính sống ....................................................................................46

III.1.2.3. Phân bố.............................................................................................46

III.1.2.4. Nhận xét ...........................................................................................46

III.1.3. Conus imperialis Linnaeus, 1758 .........................................................49

III.1.3.1 Đặc điểm hình thái............................................................................49

III.1.3.2. Tập tính sống ....................................................................................50

III.1.3.3. Phân bố.............................................................................................50

III.1.3.4. Nhận xét ...........................................................................................50

III.1.4. Conus quercinus Lightfoot, 1786 .........................................................52

III.1.4.1. Đặc điểm hình thái...........................................................................52

III.1.4.2. Tập tính sống ....................................................................................53

III.1.4.3. Phân bố.............................................................................................54

iii

III.1.4.4. Nhận xét ...........................................................................................54

III.1.5. Conus lividus Hwass in Bruguière, 1792..............................................54

III.1.5.1. Đặc điểm hình thái...........................................................................54

III.1.5.2. Tập tính sống ....................................................................................56

III.1.5.3. Phân bố.............................................................................................56

III.1.5.4. Nhận xét ...........................................................................................56

III.1.6. Conus capitaneus Linné, 1758 .............................................................58

III.1.6.1. Đặc điểm hình thái............................................................................58

III.1.6.2. Tập tính sống ....................................................................................59

III.1.6.3. Phân bố.............................................................................................59

III.1.6.4. Nhận xét ...........................................................................................59

III.1.7. Conus caracteristicus Fischer, 1807 ....................................................60

III.1.7.1. Đặc điểm hình thái............................................................................60

III.1.7.2. Tập tính sống ....................................................................................61

III.1.7.3. Phân bố.............................................................................................62

II.1.7.4. Nhận xét.............................................................................................62

III.1.8. Conus betulinus Linné, 1758................................................................62

III.1.8.1. Đặc điểm hình thái............................................................................62

III.1.8.2. Tập tính sống ....................................................................................63

III.1.8.3. Phân bố.............................................................................................63

III.1.8.4. Nhận xét ...........................................................................................63

III.2. GIẢI PHẪU TUYẾN NỌC ĐỘC ...........................................................66

III.3. KIỂM CHỨNG PHÂN LOẠI 3 NHÓM LOÀI CÓ HÌNH THÁI CHƯA RÕ NÉT

BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ DNA TY THỂ.........................................................68

iv

III.3.1. C. marmoreus và C. bandanus.............................................................69

III.3.2. Conus leopardus và Conus litteratus....................................................72

III.3.3. C. distans và Conus cf. distans.............................................................75

III.4. THẢO LUẬN.........................................................................................78

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................81

IV.1. Kết luận..................................................................................................81

IV.2. Kiến nghị................................................................................................81

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................82

A. TÀI LIỆU TRONG NƯỚC.........................................................................82

B. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI..........................................................................82

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Superfamily của conotoxin và conopeptide (Bingham, 2010) ................20

Bảng 1.2: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng.................................23

Bảng 1.3: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein...........................26

Bảng 2.1: Thông số dùng để phân loại kích cỡ chiều dài của ốc theo Verlag Christa

Hemmen (1995).....................................................................................................35

Bảng 2.2: Công thức được dùng để phân loại trọng lượng của các loài ốc theo

Verlag Christa Hemmen (1995).............................................................................35

Bảng 2.3: Công thức dùng để phân loại hình thái của ốc cối theo Verlag Christa

Hemmen (1995).....................................................................................................35

Bảng 2.4: Công thức dùng để phân loại kích cỡ của ốc cối theo Verlag Christa

Hemmen (1995).....................................................................................................36

Bảng 2.5: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR.....................40

Bảng 3.1: Bảng giá trị tính theo công thức chuẩn quốc tế của các loài ốc cối.........43

Bảng 3.2: Các thông số hình thái của Conus marmoreus .......................................44

Bảng 3.3: Các thông số hình thái của Conus bandanus..........................................46

Bảng 3.4: Các thông số hình thái của Conus imperialis. ........................................49

Bảng 3.5: Các thông số hình thái của Conus quercinus..........................................53

Bảng 3.6: Các thông số hình thái của Conus lividus...............................................55

Bảng 3.7: Các thông số hình thái của Conus capitaneus........................................59

Bảng 3.8: Các thông số hình thái của Conus caracteristicus.................................61

Bảng 3.9: Các thông số hình thái của Conus betulinus...........................................63

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Khu vực phân bố của Conus. marmoreus (1) và C. bandanus (2) trên thế

giới..........................................................................................................................4

Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus ssp.)....................................6

Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) ........................7

Hình 1.4: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam. ......................7

Hình 1.5: Cấu tạo bên trong của ốc cối ....................................................................8

Hình 1.6: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối...............................10

Hình 1.7: Phương thức săn mồi (cá) dạng móc câu của Conus striatus...................10

Hình 1.8: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối .............................................11

Hình 1.9: Cơ chế bắt mồi theo dạng lưới của Conus geographus...........................11

Hình 1.10: Vòng đời của ốc cối .............................................................................12

Hình 1.11: a: Conus achatinus :bọc trứng gắn trên vật bám (động vật 2 mảnh vỏ);

b: Bọc trứng của C. nivifer.....................................................................................13

Hình 1.12: Cấu tạo tuyến độc tố của ốc cối............................................................14

Hình 1.13: Cấu trúc răng kitin của ốc cối...............................................................16

Hình 1.14: Cấu trúc răng kitin của một số loài ốc cối.............................................16

Hình 1.15: DNA ty thể người ................................................................................24

Hình 1.16: Cấu trúc hệ gen ribosome.....................................................................26

Hình 1.17: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile...............................................32

Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu ốc cối tại vùng biển Nam Trung Bộ...........................33

Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của ốc cối và các thông số hình thái ..........................34

Hình 2.3: Các dạng hình dạng vỏ của Conus tính theo công thức..........................36

Hình 2.4: quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự......................38

Hình 2.5: Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR của gen 16S mtDNA .........................40

Hình 2.6: Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR của gen ITS2 rRNA ..........................41

Hình 3.1. Hình dáng bên ngoài của Conus marmoreus và C. bandanus.................47

Hình 3.1.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus marmoreus tại các vùng địa lý

trên thế giới ...........................................................................................................48

vii

Hình 3.1.2: Các dạng hình thái khác nhau của Conus bandanus tại các vùng địa lý

trên thế giới ...........................................................................................................48

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái ngoài của Conus imperialis và C. quercinus............51

Hình 3.2.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus imperialis tại các vùng địa lý

trên thế giới ...........................................................................................................51

Hình 3.2.2: Các dạng hình thái khác nhau của Conus quercinus tại các vùng địa lý

trên thế giới ...........................................................................................................52

Hình 3.3: Đặc điểm hình thái ngoài của Conus lividus (Hình trên) và C. capitaneus.

(Hình dưới). a: mặt trước; b: tháp vỏ; c: mặt sau....................................................57

Hình 3.3.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus lividus tại các vùng địa lý trên

thế giới ..................................................................................................................57

Hình 3.3.2. Các dạng hình thái khác nhau của Conus capitaneus tại các vùng địa lý

trên thế giới ...........................................................................................................58

Hình 3.4: Đặc điểm hình thái ngoài của C. caracteristicus và C. betulinus............64

Hình 3.4.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus caracteristicus tại các vùng

địa lý trên thế giới .................................................................................................65

Hình 3.4.2 : Các dạng hình thái khác nhau của Conus betulinus tại các vùng địa lý

trên thế giới ...........................................................................................................65

Hình 3.5: Tuyến nọc độc của một số loài ốc cối.....................................................66

Hình 3.6: Cấu trúc răng kitin của ba loài ốc cối .....................................................67

Hình 3.7: Kết qủa điện di DNA tổng số của ốc cối ................................................68

Hình 3.8: Sản phẩm PCR gen 16S mtDNA và ITS2 rDNA...................................68

Hình 3.9: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus marmoreus và C. bandanus..........70

Hình 3.10: Trình tự gen ITS2 rDNA của Conus marmoreus và C. bandanus.........71

Hình 3.11: Đặc điểm hình thái của Conus leopardus và C. litteratus (hình dưới)...72

Hình 3.12: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus litteratus và C. Leopardus........ 74

Hình 3.13: Đặc điểm hình thái của C. distans và Conus cf. distans........................75

Hình 3.14: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus distans (from Genbank) và Conus

cf. distans. .............................................................................................................77

1

LỜI NÓI ĐẦU

Với hơn 550 loài được biết đến hiện nay, giống ốc cối (Conus spp.) dường

như là giống lớn nhất trong các động vật sống ở đại dương. Cùng với việc góp phần

vào sự đa dạng sinh học biển, ốc cối cũng có vai trò quan trọng về mặt sinh thái - có

đến hơn 36 loài cùng xuất hiện ở 1 nhánh triền san hô (Kohn, 2001); về mặt tiến

hóa - tỉ lệ đa dạng (net diversification rate) của ốc cối cao nhất trong lớp chân bụng

(Stanley 2007); về mặt kinh tế thì ốc cối rất đa dạng về hình dạng cũng như màu sắc

hoa văn vì vậy vỏ của chúng được khai thác làm đồ mỹ nghệ và về mặt sinh học

thần kinh và y học - ốc cối có rất nhiều các neuropeptides đặc hiệu trong độc tố của

chúng (Olivera, 2006). Chính vì vậy, việc định danh loài và xác định mối quan hệ

tiến hóa của ốc cối là rất cần thiết.

Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thước vỏ, kiểu, hoa văn và

màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đường gờ hay phần lồi trên vỏ (Kohn và

cs, 1999). Tuy nhiên, việc định danh loài ốc cối bằng mẫu sống thường gặp nhiều

khó khăn do sự biến dị liên quan đến vùng phân bố hoặc biến dị cá thể. Hơn nữa,

lớp bọc ngoài vỏ ốc (periostracum) thường đục và bao phủ toàn bộ vỏ khiến các vân

màu sắc bị che khuất. Việc lọai bỏ lớp bao này bằng KOH (hoặc NaOH) có thể ảnh

hưởng đến các vân màu và không thể áp dụng đối với mẫu vật sống. Đặc điểm hình

thái có thể chịu tác động của môi trường, biến dị cá thể cùng loài (Intraspecific) và

khác loài (Interspecific), dễ gây nhầm lẫn trong quá trình phân loại. Không chỉ có

các thành phần độc tố là đặc trưng cho loài, các biến dị liên quan đến vùng địa lý và

tuổi cũng đã được ghi nhận (Bingham và cs, 1996). Chính vì vậy, hệ thống phân

loại của loài ốc cối hiện nay vẫn còn nhiều tranh cãi và đôi khi mang lại kết quả

không chính xác.

Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một

cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết (Blaxter 2003,

2004; Hebert và cs, 2003a, b; Stoeckle 2003). Các chỉ thị phân tử của DNA ty thể

thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị của DNA nhân. Đối với các động vật