Đánh giá hoạt động của một số gen liên quan đến tổng hợp, tích lũy tinh bột và thử nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁNH GIÁ HOAṬ ĐÔṆ G CỦA MÔṬ SỐ GEN LIÊN QUAN

ĐẾN TỔNG HƠP̣ , TÍCH LŨY TINH BÔṬ VÀ THỬ

NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁNH GIÁ HOAṬ ĐÔṆ G CỦA MÔṬ SỐ GEN LIÊN QUAN

ĐẾN TỔNG HƠP̣ , TÍCH LŨY TINH BÔṬ VÀ THỬ

NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

ĐÁNH GIÁ HOAṬ ĐÔṆ G CỦA MÔṬ SỐ GEN LIÊN QUAN

ĐẾN TỔNG HƠP̣ , TÍCH LŨY TINH BÔṬ VÀ THỬ

NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Bích Ngọc

Viện Công nghệ sinh học

2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà

Viện Công nghệ sinh học

HÀ NỘI - 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của

PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS. Chu Hoàng Hà.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của

các đồng tác giả; phần còn lại chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong

luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả

Nguyễn Thị Minh Hồng

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS.

Chu Hoàng Hà đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi

trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Bên cạnh đó, tôi xin

chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật,

phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trung tâm tài nguyên thực vật, Trung tâm

nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Trại thực nghiệm sinh học Cổ

Nhuế đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong

khuôn khổ đề tài: “Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống

sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống chịu bệnh và

năng suất cao bằng công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa

học và công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ; thời gian thực hiện từ 6/2012

đến 6/2015 do PGS.TS. Phạm Bích Ngọc làm chủ nhiệm.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, và

Bộ phận phụ trách đào tạo đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nghiên cứu

và hoàn thiện luận án.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức

Thanh Hóa, Lãnh đạo khoa và cán bộ trong bộ môn Khoa học cây trồng, Bảo vệ

thực vật, khoa Nông Lâm Ngư nghiệp, ĐH Hồng Đức đã tạo điều kiện thuận lợi để

tôi yên tâm công tác, học tập và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Minh Hồng

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................4......4

1.1. Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn............. 4 4

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại..................................................................................... 4 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền ........................................................ 5 5

1.1.3. Giá trị của cây sắn............................................................................................. 8 8

1.1.4. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam............................................. 9 9

1.1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn................................ 13.13

1.1.6. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay ....................................................... 15 15

1.2. Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn......................................... 19

1.2.1. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật ....................................................... 19 19

1.2.2. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan ....................................... 20 20

1.3. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen ........ 27 27

1.3.1. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn................................................................ 27..27

1.3.2. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn........................................................... 32 32

1.3.3. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen ................................................... 35 35

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................ 43 43

2.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 43 43

2.1.1. Vật liệu thực vật .............................................................................................. 43 43

2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector ................................................................................... 43 43

2.1.3. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm ....................................................................... 43 43

2.1.4. Môi trường nuôi cấy........................................................................................ 44 44

2.1.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu................................................................45...45

2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 45 45

2.2.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh

giá .............................................................................................................................. 45 45

2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử................................................................ 45.45

2.2.3. Phương pháp phân lập gen và promoter ......................................................... 51 51

2.2.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen ................................................. 52 52

2.2.5. Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giống sắn phuc̣ vu ̣cho nghiên cứu ............. 54 54

iv

2.2.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật...................................................... 54 54

2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens........................ 55 55

2.2.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển ......................................... 56 56

2.2.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen............................... 57 57

2.2.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu......................................................... 60 60

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 61..61

3.1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan

đến trao đổi chất tinh bột .......................................................................................61 61

3.1.1. Lựa chọn các giống sắn sử dụng ..................................................................... 61 61

3.1.2. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn .............................................................................. 62 62

3.1.3. Tách chiết ARN tổng số.................................................................................. 63 62

3.1.4. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn

phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA ................................................. 64 64

3.1.5. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu

hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột ....................... 65 65

3.1.6. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá

trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và

củ sắn.........................................................................................................................66 66

3.2. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và

thiết kế vector chuyển gen .......................................................................................... 75

3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu ............................................................................... 75 75

3.2.2. Phân lập gen SSIV ở sắn................................................................................. 76 76

3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen ............................................................................. 82 82

3.3. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh

tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá............................................................................87 87

3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen

chuyển ....................................................................................................................... 87 87

3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển................................................................ 91 92

3.3. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường

sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá ................................................................ 87 ...

3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen

chuyển .......................................................................................................................87

87

3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển................................................................ 92 92

v

3.4. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn.............. 99 99

3.4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn.................................................... 99 99

3.4.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen

GUS......................................................................................................................... 106106

3.4.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột............. 113113

Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ...................................................................... 118118

4.1. Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất

tinh bột............................................................................................................. 118

4.2. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc

lá.............................................................................................................................. 122122

4.3. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn............ 124124

4.3.1. Hệ thống tái sinh cây sắn .............................................................................. 124124

4.3.2. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A. tumefaciens................................... 126126

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 130130

TÓM TẮT TIẾNG ANH…………………………………………………… 131

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ…………………………………………...…….. 136

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 137137

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng của sắn 9

Bảng 1.2 Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của các vùng trên thế giới

trong năm 2014 – 2015 10

Bảng 1.3 Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam từ năm

2010 – 2014 12

Bảng 1.4 Một số công trình nghiên cứu tái sinh invitro ở cây sắn 29

Bảng 1.5 Tổng kết một số công trình công bố về chuyển gen vào cây sắn 36

Bảng 3.1 Đặc điểm của một số giống sắn sử dụng trong phân tích biểu

hiện gen 62

Bảng 3.2 Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu RNA tổng số tách chiết

từ lá và củ các giống sắn 63

Bảng 3.3 Cơ sở dữliêụ các gen liên quan đến quá

trình sinh tổng hơp̣

tinh bôṭ ở sắn 66

Bảng 3.4 Trình tự các cặp mồi để khuếch đại các gen quan tâm 75

Bảng 3.5 Trình tự các cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng

hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen 76

Bảng 3.6 Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen SSIV ở giống

KM140 so với gen tham chiếu 78

Bảng 3.7 Vị trí sai khác trong trình tự axit amin suy diễn của protein

SSIV của gen phân lập 79

Bảng 3.8 Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S: SSIV:T35S và pBI121-

C54: SSIV:NOST vào thuốc lá………………………………... 90

Bảng 3.9 Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong lá và trong rễ cây thuốc lá

chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S ở các dòng

chuyển gen 97

Bảng 3.10 Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong rễ cây thuốc lá chuyển gen

pBI121 – C54: SSIV: NOST ở các dòng chuyển gen 98

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu và môi trường đến khả năng

tạo mô sẹo (sau 3 tuần) 100

Bảng 3.12 Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi trên môi trường CI 102

Bảng 3.13 Tỷ lệ phôi soma tạo cây con 104

Bảng 3.14 Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa 105

vii

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển

gen giống sắn KM140 108

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của Kanamycin đến khả năng sống sót của mô sẹo

chuyển gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140 109

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của Kanamycin đến tỷ lệ ra rễ của chồi giống sắn

HB80 và KM140 110

Bảng 3.18 Tạo cây sắn HB80 và KM140 chuyển gen GUS thông qua

A.tumefaciens 111

Bảng 3.19 Chuyển gen pBI121- C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140 114

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz) 6

Hình 1.2 Một số phương pháp phổ biến tạo cây sắn biến đổi gen 18

Hình 1.3 Công thức hóa học của tinh bột 20

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan 21

Hình 1.5 Quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây sắn 31

Hình 1.6 Kết quả tạo mô sẹo phôi hoá ở giống sắn TME 14 32

Hình 2.1 Trình tự đoạn cmyc và vị trí của các mồi PCR 53

Hình 2.2 Quá trình canh tác và

thu hoac̣ h các giống sắn quan tâm taị Traị

thưc̣ nghiêṃ sinh học Cổ Nhuế phuc̣ vu ̣nghiên cứu 54

Hình 2.3 Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột trong lá bằng phương

pháp nhuộm iodine

58

Hình 2.4 Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ lá

cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S

59

Hình 2.5

Hình 3.1

Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ rễ

cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV: NOST

Hình ảnh minh họa vị trí lá và củ sắn

60

62

Hình 3.2 RNA tổng số tách chiết từ các mẫu củ (A) và lá các giống sắn (B) 63

Hình 3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn 64

Hình 3.4 Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPS qua các giai đoạn

phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 67

Hình 3.5 Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPL qua các giai đoạn

phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 68

Hình 3.6 Phân tích mức độ biểu hiện gen GBSS qua các giai đoạn phát

triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 69

Hình 3.7 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSI, SSIII, SSIV qua các

giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 71

Hình 3.8 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSII qua các giai đoạn phát

triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR

72

Hình 3.9 Phân tích mức độ biểu hiện của gen SBE qua các giai đoạn phát

triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR 74

Hình 3.10 Tách dòng đoạn gen SSIV từ củ sắn 77

Hình 3.11 Tách dòng promoter C54 ở sắn 81

Hình 3.12 Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 83

Hình 3.13 Thiết kế vector pBI121/cmyc 84

Hình 3.14 Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST 85

ix

Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A.

tumefaciens 88

Hình 3.16 Một số hình ảnh chuyển các gen quan tâm vào thuốc lá thông

qua vi khuẩn A.tumefaciens 89

Hình 3.17 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D￾35S:SSIV:T35S bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu

SSIV-Frag_F/R 91

Hình 3.18 Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121-

C54:SSIV:NOST 91

Hình 3.19 Kết quả Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen SSIV 92

Hình 3.20 Ảnh điện di RNA tổng số được tách từ các mẫu thuốc lá chuyển gen 93

Hình 3.21 Kết quả PCR nhân gen actin từ cDNA của lá từ một số dòng

thuốc lá chuyển gen 94

Hình 3.22 Điêṇ di sản phẩm RT-PCR của các gen SSIV ở các dòng thuốc

lá chuyển gen tương ứng 95

Hình 3.23 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc

pK7WG2D-35S:SSIV:T35S 96

Hình 3.24 Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI

121 – C54:SSIV: NOST 98

Hình 3.25 Mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau 101

Hình 3.26 Các khối mô sẹo phân hóa các giai đoạn mô phôi khác nhau ở 5

giống sắn thí nghiệm 103

Hình 3.27 Chồi và cây sắn tái sinh từ mô sẹo phôi hóa 106

Hình 3.28 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biến nạp gen

GUS ở giống sắn HB80 và KM140 107

Hình 3.29 Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 và KM140 112

Hình 3.30 Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST vào

giống sắn KM140 115

Hình 3.31 Cây sắn giống KM140 chuyển gen SSIV được trồng ở nhà lưới 115

Hình 3.32 Điện di DNA tổng số các dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc

pBI121-C54:SSIV:NOST 116

Hình 3.33 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với

cặp mồi promoter C54F/SSIV-R 116

Hình 3.34 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với

cặp mồi virF/R 117

x

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

µl Microliter

µM Micromolar

2.4D axit 2,4-diclophenoxiaxetic

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

AGPase ADP-glucose pyrophosphorylase

AS Acetosyringone

BAP 6 – Benzyl amino purine

bp Base pair cặp bazơ nitơ

cDNA Complementary DNA

CG Chuyển gen

CIAT International Center for Tropical

Agriculture

Trung tâm nông nghiệp

nhiệt đới quốc tế

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

Cs, et al., Cộng sự, đồng tác giả

DBE Debranching enzyme enzyme phân rã tinh bột

DNA Deoxiribonucleic Acid

Đỏ ĐF Đỏ địa phương

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

EtBr Ethidium Bromid

FEC Friable embryo callus Mô sẹo phôi hóa

GBSS granule-bound synthetase enzyme tổng hợp amylose

GUS β –Glucuronidase gene Gen GUS

HSPs Heat shock proteins

IBA Indol -3- butyric acid

Kb Kilo base

Kinetin 6 – fufuryl amino purine

Km Kanamycin

xi

KM140 KM140 (KM98-1 x

KM36)

LB Luria –Bertani Môi trường LB

M Marker Thang chuẩn

mRNA messenger RNA RNA thông tin

MS Murashige and Skoog Môi trường MS

MTCL

Mg Miligam

mg/L;

mg/mL; ng/g

Miligam/lit; miligam/mililit;

nanogam/gam

NAA α – Napthyl acetic acid

nptII Neomycin photphotranspherase gene

OD Optical density Mật độ quang học

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

Picloram 4-amino-3,4,5 tricloro pyridine - 2-

cacboxylic acid

RM Rooted Medium Môi trường ra rễ

RT-PCR Realtime polymerase chain reaction

SBE Starch branching enzyme enzyme phân nhánh tinh

bột

SS Starch synthase Enzyme sinh tổng hợp tinh

bột

SSIV Starch synthase IV Enzyme sinh tổng hợp tinh

bột nhóm IV

T-DNA Transfer-DNA DNA vận chuyển

Trắng HB Trắng Hòa Bình

Trắng NA Trắng Nghệ An

WP Working package Nội dung

WT Dòng không chuyển gen

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

glucuronide

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong những loại cây lương thực

chủ lực quan trọng nhất đối với nhiều nước trên thế giới do chúng khả năng cung

cấp carbonhydrate cao, thậm chí trong các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như lượng

mưa thấp, hạn hán hoặc đất nghèo dinh dưỡng.

Hiện nay, trong bối cảnh biến đổi khí hậu làm trái đất nóng lên, nước biển

dâng cao, đe dọa an ninh lương thực thế giới và sự cạn kiệt của nguồn nguyên liệu

hóa thạch thì cây sắn được coi là cây trồng đem lại giải pháp kép nhằm đạt cả hai

mục tiêu: góp phần đảm bảo an ninh lương thực và cung cấp nguyên liệu cho công

nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, từng bước thay thế nhiên liệu hóa thạch.

Trong kế hoạch 5 năm 2015 - 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn. Kế

hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha vào năm 2015

và ổn định diện tích 450.000 ha vào năm 2020, năng suất đạt khoảng 21 tấn/ha. Nếu

đạt được theo kế hoạch với mức sản lượng 11 triệu tấn thì vẫn sẽ xảy ra tình trạng

tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản xuất ethanol với các nhà máy thức ăn

chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn và lượng sắn dùng cho xuất khẩu.

Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng như là nguồn lương

thực và nguyên liệu công nghiệp. Hiện nay, việc cải tiến cây trồng theo hướng tăng

hàm lượng tinh bột là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được

các nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Do vậy, các nghiên cứu tìm hiểu về con

đường tổng hợp và phân hủy tinh bột ở cây trồng nói chung và đối với sắn nói riêng

sẽ góp phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột.

Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm xây dựng hệ thống tái sinh in

vitro và chuyển gen tạo cây sắn có hàm lượng tinh bột cao, phù hợp với mục đích

sử dụng phục vụ cho công nghiệp và xuất khẩu là một vấn đề cấp thiết ở nước ta.

Ngoài ra, các hướng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học ở

cây sắn chưa được quan tâm và phát triển nhiều. Đặc biệt, chưa có những nghiên

2

cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các

giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ gen.

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đề xuất nhiệm vụ nghiên cứu “Đánh giá

hoaṭ đôṇ g của môṭ số gen liên quan đến tổng hơp̣ , tích lũy tinh bôṭ và thử

nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn”.

2. Mục tiêu nghiên cứu

Bước đầu đã chuyển được gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới

sự điều khiển của promotor đặc hiệu C54 vào giống sắn KM140 nhờ A.tumefaciens

thông qua FEC.

3. Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên

quan đến trao đổi chất tinh bột.

Nội dung 2: Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hơp̣ tinh bôṭ, thiết

kế vector chuyển gen.

Nội dung 3: Đánh giá khả năng tổng hợp tinh bôṭ của gen SSIV trên cây thuốc

lá mô hình.

Nội dung 4: Chuyển gen SSIV vào cây sắn.

4. Những đóng góp mới của luận án

+ Đã phân lập và đánh giá được hoạt động của gen SSIV liên quan đến quá

khả năng tổng hợp tinh bột từ lá và củ sắn.

+ Đã thu được những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pB121-

C54:SSIV-cmyc:NOST với mức độ tích lũy hàm lượng tinh bột cao hơn so với

những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S từ 19,7

– 48,1% và cao hơn 15,6 – 65,7% so với cây đối chứng.

+ Đây là công trình đầu tiên chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

SSIV dưới sự điều khiển promoter đặc hiệu ở củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC)

của giống sắn KM140 thông qua A. tumefaciens. Kết quả bước đầu thu được 7 dòng

sắn chuyển gen dương tính khi kiểm tra với PCR.