Chiết tách, phân lập Andrographolide từ xuyên tâm liên (Andrographis paniculata) sản xuất chất kiểm định các loại thực phẩm có chứa Andrographolide: Báo cáo tổng kết đề tài khoa học cấp Trường

BỘ CÔNG THƯƠNG

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: CHIẾT TÁCH, PHÂN LẬP ANDROGRAPHOLIDE TỪ XUYÊN

TÂM LIÊN (Andrographis paniculata) SẢN XUẤT CHẤT KIỂM ĐỊNH CÁC

LOẠI THỰC PHẨM CÓ CHỨA ANDROGRAPHOLIDE

Mã số đề tài: 19.2TP01

Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN NGỌC TUẤN

Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học – Thực Phẩm

1

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG

I. Thông tin tổng quát

1.1. Tên đề tài: Chiết tách, phân lập andrographolide từ xuyên tâm liên (Andrographis

paniculata) sản xuất chất kiểm định các loại thực phẩm có chứa andrographolide

1.2. Mã số: 19.2TP01

1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT

Họ và tên

(học hàm, học vị)

Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

1 Nguyễn Ngọc Tuấn Viện Công Nghệ Sinh

học – Thực Phẩm

Chủ nhiệm đề tài

2 Nguyễn Thị Ngần Viện Công Nghệ Sinh

học – Thực Phẩm

Thành viên đề tài

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm

1.5. Thời gian thực hiện:

1.5.1. Theo hợp đồng: 12 tháng từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020

1.5.2. Gia hạn (nếu có): không có

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 10 năm 2020

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu: không có

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 45 triệu đồng.

II. Kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề

Theo ước tính, 70% dân số toàn cầu vẫn sử dụng thuốc từ dược liệu trong chăm sóc sức

khỏe ban đầu tại cộng đồng. Cuộc sống ngày càng phát triển, con người ta đặt ra nhu cầu

cao hơn cho chất lượng cuộc sống của mình, đặc biệt là về vấn đề sức khỏe. Vậy nên trong

cuộc cách mạng phát triển ngành công nghệ thực phẩm, thực phẩm chức năng đã trở thành

một vấn đề thiết yếu và được quan tâm nhiều hơn [1].

Xuyên tâm liên là một loại thảo dược được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc đông y

(Trung Quốc), Ayurveda (Ấn Độ) và các khu vực khác ở châu Á, xuyên tâm liên từng được

xem như là một vị thuốc ko thể thiếu trong việc điều trị các bệnh có kèm theo sốt, các bệnh

về gan, mắt, các bệnh liên quan đến đường hô hấp. Nhận thấy tầm quan trọng của xuyên

tâm liên về công dụng chữa bệnh đa năng của nó, hiện nay nước ta đã có nhiều nơi phát

triển vùng trồng xuyên tâm liên, tạo điều kiện khôi phục và sử dụng loại thảo dược này [2],

[3], [4].

2

Xuyên tâm liên với thành phần chính là andrographolide có nhiều công dụng tốt cho sức

khỏe nhưng chưa được nghiên cứu định lượng cũng như phân tách để đưa vào ứng dụng

thiết thực hơn như làm nguyên liệu trong sản xuất thực phẩm chức năng hoặc dùng làm chất

chuẩn trong kiểm nghiệm sản phẩm trên thị trường (hiện nay số lượng thực phẩm chức năng

ngày phong phú đa dạng với nhiều nguồn gốc xuất xứ khác nhau nhưng ngân hàng chất

chuẩn ở các đơn vị kiểm nghiệm lại không nhiều dẫn đến khó khăn trong công tác quản lý

đánh giá chất lượng sản phẩm) [2], [3], [4].

Hiện nay tại Việt Nam chưa có chất chuẩn andrographolide nên khi có nhu cầu sẽ phải đặt

mua từ nước ngoài với giá khá đắt (khoảng 475 USD cho 50 mg andrographolide (reference

standard), hoặc 108 USD cho 5 mg andrographolide (analytical standard) – theo

https://www.sigmaaldrich.com).

Với mong muốn góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu, xây dựng quy trình

kiểm nghiệm các chế phẩm có chứa xuyên tâm liên, bài nghiên cứu này nhằm phân lập

Andrographolide từ xuyên tâm liên làm chất chuẩn, thẩm định quy trình định lượng phù hợp

và sử dụng quy trình đã xây dựng để định lượng một số mẫu thực phẩm chức năng chứa

Andrographolide đang được lưu hành trên thị trường bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC).

2. Mục tiêu

Xây dựng phương pháp phân tích và định lượng hợp chất Andrographolide bằng sắc ký hiệu

năng cao.

Thẩm định quy trình định lượng có chính xác và phù hợp để đưa ra kết luận được chuẩn

phân tách được đủ tiêu chuẩn cơ sở thành chuẩn gốc (primary standard).

Ứng dụng vào quy trình kiểm định các mẫu thuốc có Andrographolide trong thành phần cao

xuyên tâm liên để so sánh kết quả định lượng.

3. Phương pháp nghiên cứu

3.1. Phương pháp chiết xuất.

Phương pháp chiết xuất dùng để nghiên cứu sơ bộ khi chưa biết thành phần hóa học của

dược liệu. Phương pháp cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân

cực mạnh để phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu. Có hai cách chiết là chiết ở nhiệt độ

thường là chiết nóng.

Thường sử dụng cách chiết nóng bằng máy chiết liên tục (Shoxlet) hoặc chiết hồi lưu. Sau

mỗi lần chiết với một loại dung môi, làm khô dược liệu rồi tiếp tục chiết với dung môi tiếp

theo. Mỗi phân đoạn chiết, ta cất loại dung môi để thu được cao chiết và tiến hành phân tích

riêng.

Để thu hồi dung môi, sử dụng máy cô quay chân không cho hiệu suất cao.

3.2.Các phương pháp sắc kí : Các phương pháp sắc ký được sử dụng bao gồm sắc ký

cột, sắc ký bản mỏng, rây phân tử

3

3.3. Các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất: Cấu trúc các hợp chất được khảo

sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối

lượng (EI-MS), (ESI-MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng

hưởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc

lập thể tương của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR.

3.4. Phương pháp tinh chế

- Kết tinh trong dung môi: hòa tan bão hòa tinh thể sau phân lập vào một

lượng nhỏ dung môi ở nhiệt độ nóng, khi làm lạnh hoặc bay hơi dung dịch có hiện

tượng quá bão hòa và hợp chất chính kết tinh trong khi tạp chất chưa đạt được nồng

độ bão hòa vẫn nằm trong trong dung dịch, lọc lấy tinh thể. Kết tinh lại nhiều lần sẽ

thu được hợp chất có độ tinh khiết theo yêu cầu [1], [36-37].

- Lặp lại quá trình sắc kí cột giống như giai đoạn phân lập, lựa chọn phân

đoạn tinh khiết hơn hoặc thay đổi dung môi rửa giải hay tỉ lệ thành phần của dung

môi rửa giải.

- Tiến hành sắc kí cột như giai đoạn phân lập, nhưng thay đổi kiểu sắc kí, ví

dụ như giai đoạn phân lập sử dụng sắc kí hấp phụ pha thuận trên silica gel, giai

đoạn tinh chế sử dụng sắc kí phân bố pha đảo trên C18 hoặc sắc kí thấm qua gel.

- Sử dụng sắc ký lỏng điều chế để tinh sạch các hợp chất phân lập được để đạt độ tinh khiết

theo yêu cầu sử dụng làm chất chuẩn phân tích.

3.5. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất

Sắc kí lớp mỏng: TLC được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết dựa vào sự có

mặt của vết duy nhất hoặc vết chính là vết của đối tượng phân tích. Chất càng tinh

khiết khi không có vết phụ hoặc vết phụ càng nhỏ [38], [39].

Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất và tính gần

đúng tỉ lệ tạp chất dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích peak [40-42].

3.6.Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất [39]

Các hợp chất đối tượng nghiên cứu của đề tài đều là những chất đã biết cấu trúc. Dữ liệu

chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng

chuẩn. Việc nhận dạng chất dựa vào:

- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện.

- So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lí, hằng số vật lí của chất với tài liệu khoa học hoặc

thông tin đã công bố. Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là

đúng đối tượng nghiên cứu.

Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có: Đo điểm chảy; đo phổ tử

ngoại khả kiến; đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), đo

phổ khối lượng (MS).

4

3.7. Phương pháp kiểm soát chất lượng phân tích [35], [44]

- Tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với các dung dịch chuẩn, tự tạo hay mẫu

thử (ít nhất 6 lần tiêm), ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích peak

trung bình và các thông số khác của peak (độ phân giải, hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết...).

Yêu cầu:

- Độ phân giải giữa peak liền kề với peak của chất cần phân tích phải ≥ 1,5.

- Số đĩa lý thuyết ≥ 2000.

- Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (với phép thử định

lượng). Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp.

- Các thông số khác của peak phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp HPLC quy định

trong Dược điển và quy định cụ thể trong quy trình phân tích thẩm định.

- Khoảng nồng độ tuyến tính:

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn (5 dung dịch), ghi lại các sắc ký đồ và xác định đáp

ứng của peak. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ

chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng peak thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp

bình phương tối thiểu. Yêu cầu với phép thử định lượng hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997

(hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp.

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích (LOD) được xác định theo “quy tắc 3”.

- Tín hiệu đo ứng với LOD (yLOD) = tín hiệu mẫu trắng (yB) + 3*độ lệch chuẩn (S) của

yB;

LOD, LOQ của phương pháp phân tích được xác định theo hướng dẫn của CEEQ-Center of

expertise in analysis environmental of Quebec và NIFC - Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn

thực phẩm quốc gia: Tiến hành phân tích 10 mẫu thực tế có nồng độ chất phân tích đủ thấp

(những nồng độ lớn hơn 4 lần và nhỏ hơn 10 lần LOD, giá trị này được ước lượng từ LOD

của thiết bị), rồi từ đó tình độ lệch chuẩn S:

S = [(xi − xTB)2/(n − 1)]1/2

Trong đó, i = 1 – 10; xi: các kết quả riêng lẻ; xTB: trung bình số học.

Từ đó, tính được LOD: LOD = 3*S

LOQ = 3xLOD, R = xtb/LOD

Trong đó:

−X là nồng độ chất phân tích được trong mẫu thêm chuẩn;

−Nếu 4 < R <10: giá trị LOD phù hợp và đáng tin cậy;

−Nếu 4 < R: thêm chuẩn nồng độ cao hơn, thực hiện thì nghiệm, tình toán lại giá trị R;

−Nếu R > 10: thêm chuẩn nồng độ thấp hơn, thực hiện thì nghiệm, tình toán lại giá trị R.

5

- Độ lặp lại (repeatability)

Độ lặp lại được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD,%): RSD =

S*100/xTB. Độ lặp lại của phương pháp phân tích trong nội bộ phòng thì nghiệm

(RSDPTN) phụ thuộc vào nồng độ và được xem là độ lặp lại tốt (hay thỏa mãn yêu

cầu) khi RSDPTN ≤ ½ RSD tính theo hàm Horwitz [45] hoặc tuân thủ quy định của

AOAC (Hiệp hội các nhà khoa học phân tích của Mỹ) [46].

Bảng 2.1 Giới hạn chấp nhận về độ chính xác của phương pháp theo AOAC [47]

Thành phần phân tích % Tỷ lệ phân tích Đơn vị RSD (%)

100 1 100% 1.3

≥ 10 10-1 10% 2.7

≥ 1 10-2 1% 2.8

≥ 0.1 10-3 0.1% 3.7

0.01 10-4 100ppm 5.3

0.001 10-5 10ppm 7.3

0.0001 10-6 1ppm 11

0.00001 10-7 100ppb 15

0.000001 10-8 10ppb 21

0.0000001 10-9 1ppb 30

Độ đúng (trueness)

Độ đúng của phương pháp phân tích được đánh giá theo cách:

Phân tích mẫu thêm chuẩn (spiked sample): Cách này được áp dụng để đánh

giá độ đúng khi phân tích các hợp chất có trong thuốc và dược liệu nghiên cứu.

Trong các mẫu, chọn ngẫu nhiên một mẫu, rồi phân tích được kết quả là x1; thêm chuẩn vào

mẫu đó (nồng độ thêm chuẩn là xo; dung dịch chuẩn được pha chế từ hóa chất tinh khiết ở

phòng thì nghiệm), rồi lại phân tích mẫu đã được thêm chuẩn, được kết quả x2; từ đó, tình

độ thu hồi (Recorvery, viết tắt là Rev) theo công thức:

Rev(%) = (x2 – x1)*100/xo

Trong đó, Rev(%) là độ thu hồi tình theo phần trăm; x2 là kết quả đo mẫu

thêm chuẩn; x1 là kết quả đo mẫu không thêm chuẩn; xo là hàm lượng thêm chuẩn

vào mẫu x1 để tạo ra mẫu x2.

Phương pháp phân tích được xem là đạt được độ đúng tốt khi tuân thủ quy

định của AOAC về Rev (Rev phụ thuộc vào nồng độ chất phân tích trong mẫu).

Bảng 2.2 Giới hạn chấp nhận về độ đúng của phương pháp theo AOAC [47]

Thành phần phân tích % Tỷ lệ phân tích Đơn vị Giá trị chấp nhận (%)

100 1 100% 98-102

≥ 10 10-1 10% 98-102

6

≥ 1 10-2 1% 97-103

≥ 0.1 10-3 0.1% 95-105

0.01 10-4 100ppm 90-107

0.001 10-5 10ppm 80-110

0.0001 10-6 1ppm 80-110

0.00001 10-7 100ppb 80-110

0.000001 10-8 10ppb 60-115

0.0000001 10-9 1ppb 40-120

3.8. Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn

3.8.1. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng

Xây dựng chỉ tiêu chất lượng:

Căn cứ vào tính chất lí – hóa của nguyên liệu thiết lập chuẩn và các chỉ tiêu chất lượng

thông thường của chất chuẩn đối chiếu sơ cấp để xây dựng các chỉ tiêu chất lượng của chất

chuẩn đối chiếu cần thiết lập.

Xây dựng phương pháp đánh giá:

▪ Tham khảo Dược điển Việt Nam và các dược điển quốc tế để lựa chọn phương pháp phù

hợp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng.

▪ Khảo sát lựa chọn chương trình sắc kí thích hợp để định lượng và xác

định tạp chất.

Dựa trên công thức phân tử và cấu trúc hóa học của các hợp chất chiết xuất

từ dược liệu để tìm các các điều kiện sắc kí phù hợp như: Bản chất pha tĩnh, thành

phần pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng pha động, thể tích tiêm mẫu, nồng độ

dung dịch thử, dung môi pha mẫu.

▪ Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:

- Tính đặc hiệu (Specificity)

- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range)

- Độ chính xác (Precision)

- Độ đúng (Accuracy): Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm

chuẩn và tính thông qua tỷ lệ thu hồi:

Rev(%) = (x2 – x1)*100/xo

- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

- Sự phù hợp của hệ thống sắc kí (System suitability)

3.8.2. Qui trình thiết lập và phân tích đánh giá chất chuẩn

Đánh giá nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

7

Nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn là các hợp chất đặc trưng chiết tách từ

dược liệu, có độ tinh khiết trên 95,0%. Áp dụng phương pháp phân tích đã thẩm

định để đánh giá nguyên liệu có đáp ứng yêu cầu chất lượng không.

- Định tính: Tiến hành phương pháp đo phổ NMR hoặc phối hợp thêm

phương pháp HPLC.

- Xác định độ tinh khiết: Sử dụng một trong các phương pháp HPLC,

đo điểm chảy hoặc phối hợp.

Công thức tính hàm lượng tạp chất gần đúng theo tỉ lệ diện tích peak khi áp

dụng phương pháp HPLC:

trong đó:

Ctap : tỉ lệ phần trăm tạp chất trong mẫu phân tích

Speak : diện tích peak tạp chất

∑Speak: tổng diện tích peak

- Xác định hàm lượng: Sử dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định,

tiến hành song song với chất chuẩn liên kết.

Công thức tính hàm lượng hợp chất chính (theo nguyên trạng):

trong đó:

C : hàm lượng hoạt chất tính theo phần trăm

mchuan : khối lượng chất chuẩn liên kết

mthu : khối lượng mẫu thử

Schuan : diện tích peak của mẫu chuẩn liên kết

Sthu : diện tích peak của mẫu thử

Vchuan : thể tích pha mẫu chuẩn

Vthu : thể tích pha mẫu thử

3.9. Phương pháp xử lí số liệu [35]

Xử lí kết quả phân tích trong từng phòng thí nghiệm

Tập hợp kết quả và loại giá trị thô theo qui tắc của test – Dixon.

- Tính giá trị trung bình:

8

- Tính độ lệch chuẩn:

- Tính độ lệch chuẩn tương đối:

trong các công thức (5), (6), (7):

X : giá trị trung bình của hàm lượng hợp chất chính

xi : giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i

n: số thử nghiệm được sử dụng để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính

S : độ lệch chuẩn

RSD : độ lệch chuẩn tương đối

4. Tổng kết về kết quả nghiên cứu

4.1 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được

Mẫu AP1 sau khi phân lập được cân chính xác 1 mg cho vào vial và đem đi bảo quản lạnh ở

nhiệt độ 15oC tại trường Đại học Công nghiệp Hồ Chí Minh. Sau đó, mẫu được gửi qua

trường Đại học Khoa học tự nhiên, thành phố Hồ Chí Minh để đo MS bằng thiết bị đo MS

để xác định khối lượng phân tử và tỉ lệ m/z hấp thu cường độ bao nhiêu. Kết quả đo được

thể hiện sắc đồ PL 2.1. Sau khi thu được kết quả MS, sẽ được đem đối chiếu tỉ lệ m/z trong

bảng 4.1. Từ kết quả đo các phổ

1H-NMR (DMSO,  ppm); Phổ

13C-NMR (DMSO,  ppm)

kết hợp với phổ DEPT; HSQC; HMBC và so sánh tài liệu đã công bố [48-49] hợp chất AP1

được nhận danh là andrographolide có công thức cấu tạo như sau:

Andrographolide

9

Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất AP1 và tài liệu tham khảo

TT

13C-NMR 1H-NMR HMBC

AP1 [48] AP1 [48] 1H→13C

1 36.5 36.5 1.21; 1.73 1.21; 1.72 C20, C10, C9

2 27.9 27.8 1.65 1.65 C10, C4, C3

3 78.4 78.4 3.26 3.25 C10, C4, C19

4 42.3 42.2

5 54.4 54.3 1.21 1.21 C20, C18,

C10, C4, C19

6 24.0 23.9 1.35; 1.75 1.36; 1.75

7 37.5 37.5 1.94 (td; 13

và 4.5); 2.33

(m)

1.95 (td; 13

và 4.5); 2.32

(m)

C5

8 147.6 147.6

9 55.5 55.4 1.85 (d; 8) 1.85 (d; 8) C20, C10

10 38.6 38.5

11 24.0 23.9 1.70; 2.46 1.70; 2.46 C13, C12; C9

12 146.3 146.2 6.63 (td; 7

và 1.5)

6.62 (td; 7

và 1.5)

C11, C9; C14;

C16

13 128.9 128.8

14 64.5 64.5 4.91 (t, 6) 4.91 (t,6) C13, C12, C16

15 74.3 74.3 4.05 (dd; 10

và 2; H-15a)

4.39 (dd; 10

và 7; H-15b)

4.04 (dd; 10

và 2; H-15a)

4.39 (dd; 10

và 7; H-15b)

C13; C16

16 169.9 169.9

17 108.1 108.2 4.63 (s);

4.82 (s)

4.62 (s);

4.81 (s)

C7; C9

18 23.0 23.0 1.09 1.08 C4; C5; C19;

C3

19 62.6 62.6 3.25 (br; H￾19a); 3.86

(dd; 11 và

2.5; H-19b)

3.25 (br; H￾19a); 3.85

(dd; 11 và

2.5; H-19b)

C18; C4; C3

20 14xx.7 14.7 0.66s 0.66s C1; C10; C5;

C9

OH3 5.03 5.03 C4; C3

OH14 5.70 5.69 C14; C15; C13

OH19 4.13 4.12 C4; C19

10

4.2 Kiểm tra độ tinh khiết Andrographolide

Sử dụng phương pháp tổng diện tích peak tính toán độ tinh khiết của mẫu phân tích. Tiến

hành sắc ký theo chương trình trên, phân tích các peak phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ và

tính độ tinh khiết bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Sắc ký đồ HPLC thu

được cho các peak của hợp chất AP1 tách rõ ràng, sắc ký đồ (Hình 4.7) của chuẩn AP1 đã

tinh sạch có thời gian lưu 6.5 phút, nhiễu nền thấp ở mẫu chuẩn AP1 đã được tinh sạch, phù

hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu. Như vậy có thể dùng các điều kiện sắc

ký lựa chọn để phân tích định lượng chất AP1 có trong các mẫu thuốc và thực phẩm chức

năng.

4.3 Áp dụng phân tích mẫu thực

Trước khi áp dụng một phương pháp phân tích bất kỳ vào thực tế, bắt buộc phải thẩm định

(hay kiểm soát chất lượng) phương pháp phân tích qua các đại lượng thống kê: độ lặp lại

trong phòng thí nghiệm (hay độ chụm), độ đúng, khoảng tuyến tính, LOD và LOQ, tính

tương thích và độ đặc hiệu của phương pháp phân tích.

Khi nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích hoặc trước khi áp dụng một phương pháp

phân tích bất kỳ vào thực tế, bắt buộc phải kiểm soát chất lượng hay thẩm định phương

pháp (quality control) qua các thông số thể hiện năng lực của phương pháp (performance

parameters). Trong đó, hai thông số quan trọng nhất là độ đúng (trueness) và độ lặp lại

(precision). Đối với độ lặp lại, nếu phân tích trong nội bộ phòng thí nghiệm, người ta dùng

thuật ngữ độ lặp lại hay độ chụm (repeatability), nếu phân tích trong nhiều phòng thí

nghiệm khác nhau, người ta dùng thuật ngữ độ tái lặp hoặc độ hồi phục (reproducibility).

Chỉ khi một phương pháp phân tích vừa đạt được độ đúng tốt và độ lặp lại tốt, mới được

xem là đạt được độ chính xác (accurate) cao.

4.3.1 Thẩm định phương pháp phân tích

4.3.1.1 Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành phân tích 01 dung dịch chuẩn Andrographolide có nồng độ 160 µg/ml lặp lại 06

lần, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích peak. Độ lệch chuẩn

tương đối của thời gian và diện tích pic lần lượt là 0.055 và 0.049 (đều < 2%) và có hệ số

kéo đuôi 0.32 (< 1.5%). Điều đó cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc

ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép phân tích định tính, định lượng

Andrographolide trong mẫu thực.

Bảng 4.2 Kết quả thực nghiệm tính tương thích hệ thống

Lần Thời gian lưu tR (phút) Diện tích pic Hệ đối xứng

1 6.652 5931831 1.147

2 6.652 5932794 1.148

3 6.649 5935522 1.148

4 6.648 5934862 1.144

5 6.643 5935435 1.143

11

6 6.646 5927894 1.138

TB 6.648 5933056 1.145

RSD (%) 0.055 0.049 0.32

4.3.1.2 Độ đặc hiệu của hệ thống

Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu phân tích Andrographolide theo

chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ của peak

Andrographolide trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu

không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của

Andrographolide (tR ~ 6.5 phút).). Vậy phương pháp phân tích Andrographolide xây dựng

được có độ đặc hiệu cao.

4.3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính

Kết quả phương trình hồi quy tuyến tính thu được với Andrographolide có hệ số xác định

và hệ số tương quan rất cao, độ tuyến tính chặt, khoảng tuyến tính rộng (sự tương quan

tuyến tính giữa nồng độ của chất Andrographolide (x) và diện tích peak (y) với phương

trình hồi quy: y = 38496x + 9993.77 có hệ số xác định R

2 = 0.9997 nằm trong khoảng giới

hạn 0.99 ≤ R2 ≤ 1).

4.3.1.4 Độ lặp lại

Áp dụng quy trình phân tích đã được trình bày ở mục 2.1.1.4 để xác định hàm lượng

Andrographolide tiến hành 06 thí nghiệm riêng biệt để định lượng 01 mẫu thuốc đã lựa

chọn. Chi tiết về chuẩn bị mẫu cho phân tích theo các phương pháp trên được nêu ở mục

2.1.1.3. Các kết quả phân tích được tính theo nồng độ chất trong dung dịch mẫu (µg/mL).

Kết quả thu được cho thấy hàm lượng trung bình tìm thấy chất andrographolide là 4.6515 và

có %RSD = 0.72% . Như vậy có thể áp dụng chương trình đã lựa chọn để định lượng chất

Andrographolide trong mẫu dược liệu.

4.3.1.5 Độ đúng

Kết quả thu được cho thấy quy trình định lượng chất AP1 có khả năng thu hồi cao (> 95%)

tức là phương pháp này có độ đúng cao.

4.3.1.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích Andrographolide đến khi tín hiệu

của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N (chiều cao tín hiệu/nhiễu) đạt

khoảng 2-3. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp ứng với

từng chất. Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được xác định dựa trên giới hạn

phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD. Kết quả phân tích cho thấy phương pháp có giới hạn phát

hiện với Andrographolide là 1,5 ppm tương ứng có giới hạn định lượng là 5 ppm.

12

4.3.2 Kết quả phân tích andrographolide trong mẫu

Áp dụng quy trình sắc ký đã lựa chọn, hàm lượng chất andrographolide trong mẫu dược liệu

được thể hiện trong bảng sau

Với nồng độ Cao xuyên tâm liên là 0.2 mg/ ml, bảng sau thể hiện tỉ lệ andrographolide được

tìm thấy trong các chế phẩm thuốc trên thị trường.

Bảng 4.3 Kết quả kiểm định chất Andrographolide trong các mẫu thử

Mẫu Lặp

lại S peak

Nồng

độ tìm

thấy

(mg/L)

Hàm lượng

andrographolide tìm

thấy trong 1 viên

thuốc (%)

Hàm lượng

trung bình

trong 1 viên

thuốc (%)

M1

1 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0

RSD (%) 0 0

M2

1 33656 0.615 0.00154

2 34092 0.626 0.00156 0.00156

3 34177 0.628 0.00157

RSD (%) 0.82 1.12

M3

1 4902733 127.098 6.36

2 4970133 128.848 6.44 6.43

3 5012495 129.949 6.50

RSD (%) 1.11 1.12

M4

1 187570 4.613 0.899

2 187277 4.605 0.898 0.902

3 189568 4.665 0.910

RSD (%) 0.66 0.70

M5

1 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0

RSD (%) 0 0

13

Hình 4.1 Sắc ký đồ mẫu M1

Mẫu M1 sau quá trình định lượng có hàm lượng AP1 là 0 mg/L. Không phát hiện peak mẫu

AP1 ở khoảng thời gian lưu 6.5 phút

Hình 4.2 Sắc ký đồ mẫu M2

14

Mẫu M2 sau quá trình định lượng có hàm lượng AP1 = 0.626 mg/L và thời gian lưu 6.581

phút

Hình 4.3 Sắc ký đồ mẫu M3

Mẫu M3 có hàm lượng sau quá trình định lượng có hàm lượng AP1 = 128.848 mg/L và thời

gian lưu 6.408 phút.

Hình 4.14 Sắc ký đồ mẫu M4

Mẫu M4 sau quá trình định lượng có hàm lượng AP1 = 4.665 mg/L ở thời gian lưu 6.492

phút.