Bước đầu ứng dụng kỹ thuật PCR - Reverse Dot Blot nhằm phát hiện đồng thời một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên mẫu thit heo tươi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT

NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH

ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. CAO BẢO HIỀN

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

MSSV: 1153010315

Khóa: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT

NHẰM PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH

ĐƯỜNG RUỘT TRÊN MẪU THỊT HEO TƯƠI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. CAO BẢO HIỀN

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH

GVHD ký xác nhận: MSSV: 1153010315

Khóa: 2011 – 2015

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH i

LỜI CẢM ƠN

Em xin cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại học Mở

TP.HCM trong những năm vừa qua đã tận tình dạy bảo em, truyền đạt những kiến

thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời.

Em kính gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình

cố vấn, truyền đạt cho em những kiến thức chuyên môn bổ ích.

Em chân thành cảm ơn Thầy Lao Đức Thuận đã tạo điều kiện cho em được thực

hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường

Đại Học Mở TP.HCM.

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Trương Kim Phượng, người

đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ em trong suốt

quá trình em học tập và thực hiện khóa luận tại trường.

Em chân thành cảm ơn Công Ty Cổ Phần Công Nghệ Việt Á đã tạo điều kiện cho

em học tập kỹ thuật, hỗ trợ bộ hóa chất thí nghiệm giúp em hoàn thành tốt chuyên đề

khóa luận tốt nghiệp.

Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cao Bảo Hiền đã tận tình hỗ trợ, chuyển giao

kỹ thuật, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện chuyên đề khóa luận tốt nghiệp của

em.

Đặc biệt, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc của mình đến ba mẹ, người thân đã ủng

hộ, động viên em rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Sinh viên

DƯƠNG NGỌC HUỲNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADH Arginine dehydrolase

AMC Acetyl methyl carbinol

AMP Adenosin 3,5-cyclic mono phosphat

AP Alkaline phosphatase

BLAST Basic local alignment search tool

Bp base pair

cAMP Cyclic Andenosine monophosphate

CONS Coagulase Negative Staphylococcus

CFU Colony-forming unit

CS cộng sự

dATP deoxyadenosine triphosphate

dCTP deoxycytidine triphosphate

dGTP deoxyguanosine triphosphate

DNA deoxyribonucleic acid

dNTP deoxynucleoside triphosphate

dTTP deoxythymidine triphosphate

dUTP deoxyuridine triphosphate

IDT Integrated DNA technologies

gtt giải trình tự

LDC Lysine decarboxylase

MR Methyl Red

NBT/BCIP Nitrobluetetrazdium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase Chain Reaction

pH Potential Hydrogen

RDB Reverse Dot Blot

rDNA ribosomal Deoxyribonucleic Acid

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH iii

RNA Ribonucleic acid

rRNA ribosomal Ribonucleic Acid

S Semi-conserved

SDS Sodium dodecyl sulfate

SEs Staphylococcal enterotoxins

SNP Single nucleotide polymorphism

SSC Saline sodium citrate

T3SS type III secretion systerm

Ta annealing temperature

TDH Thermostable direct hemolysin

TE Tris - EDTA

TLH Thermolabile hemolysin

TLTK Tài liệu tham khảo

Tm melting temperature

TRH Thermostable – related hemolysin

TSI Triple Sugar Iron

VP Voges Proskauer

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng I.1. Đặc điểm của các vùng siêu biến động V1 – V9.......................................9

Bảng II.1. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R.......................... 27

Bảng II.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S-F, 16S-R.................. 28

Bảng III.1. Các vùng gen mục tiêu trong các nghiên cứu phát hiện vi khuẩn gây bệnh

đường ruột............................................................................................................. 34

Bảng III.2. Kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng nhằm phát hiện vi khuẩn gây

bệnh đường ruột .................................................................................................... 35

Bảng III.3. Các trình tự gen được sử dụng trong nghiên cứu.................................. 36

Bảng III.4. Bảng thông tin bộ mồi phổ quát của trình tự gen 16S rRNA và gen 23S

rRNA ..................................................................................................................... 37

Bảng III.5. Bảng thông tin bộ mẫu dò đặc hiệu của một số loài vi khuẩn .............. 37

Bảng III.6. Bảng thông số vật lí của bộ mồi 16S-F, 16S-R và 23S-F, 23S-R.......... 39

Bảng III.7. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng

công cụ BLAST..................................................................................................... 42

Bảng III.8. Kết quả phân tích mức độ tương đồng của cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng

công cụ BLAST..................................................................................................... 45

Bảng III.9. Bảng chỉ số OD của các mẫu DNA vi khuẩn tách chiết từ mẫu thịt heo58

Bảng III.10. Mức độ nhiễm đồng thời các vi khuẩn gây bệnh đường ruột trên mẫu thịt

heo tươi ................................................................................................................. 65

Bảng III.11. Bảng kết quả số lượng khuẩn lạc và mật độ tế bào CFU/ml ............... 67

Bảng III.12. Bảng số liệu về lượng DNA thực tế và mật độ tế bào vi khuẩn trong mẫu

thịt heo .................................................................................................................. 67

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình I.1. Nguyên tắc phương pháp PCR................................................................ 15

Hình I.2. Nguyên tắc phản ứng lai RDB ................................................................ 19

Hình III.1. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-F ..................................................... 41

Hình III.2. Kết quả BLAST trình tự mồi 16S-R..................................................... 41

Hình III.3. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-F và trình tự 16S

rDNA bằng công cụ Bioedit................................................................................... 42

Hình III.4. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 16S-R và trình tự 16S

rDNA bằng công cụ Bioedit................................................................................... 42

Hình III.5. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 16S-F, 16S-R bằng phần mềm Annhyb

.............................................................................................................................. 43

.............................................................................................................................. 44

Hình III.6. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-F ..................................................... 44

.............................................................................................................................. 45

Hình III.7. Kết quả BLAST trình tự mồi 23S-R..................................................... 45

Hình III.8. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-F và trình tự 23S

rDNA bằng công cụ Bioedit................................................................................... 46

Hình III.9. Kết quả phân tích sự tương đồng của trình tự mồi 23S-R và trình tự 23S

rDNA bằng công cụ Bioedit................................................................................... 46

Hình III.10. Kết quả phân tích trình tự cặp mồi 23S-F, 23S-R bằng phần mềm Annhyb

.............................................................................................................................. 47

Hình III.11. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAL................................................ 48

Hình III.12. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAL bằng công cụ Annhyb

.............................................................................................................................. 49

Hình III.13. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò VPA ............................................... 50

Hình III.14. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VPA bằng công cụ

Annhyb ................................................................................................................. 50

Hình III.15. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SAU................................................ 51

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH vi

Hình III.16. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAU bằng công cụ Annhyb

.............................................................................................................................. 52

Hình III.17. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CPE................................................ 53

Hình III.18. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CPE bằng công cụ Annhyb

.............................................................................................................................. 53

Hình III.19. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò CBO............................................... 54

Hình III.20. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CBO bằng công cụ

Annhyb ................................................................................................................. 55

Hình III.21. Kết quả BLAST trình tự mẫu dò SHI................................................. 56

Hình III.22. Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SHI bằng công cụ Annhyb

.............................................................................................................................. 57

Hình III.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M1 và M2 với cặp mồi 16S-F, 16S￾R ........................................................................................................................... 59

Hình III.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M3, M4 và M5 với cặp mồi 16S-F,

16S-R.................................................................................................................... 59

Hình III.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu M6 với cặp mồi 16S-F, 16S-R ... 60

Hình III.26 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M1 .................................. 61

Hình III.27. Kết quả BLAST trình tự gtt_M1F ...................................................... 62

Hình III.28 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M2 .................................. 62

Hình III.29 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M3 .................................. 63

Hình III.30 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M4 .................................. 64

Hình III.31 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M5 .................................. 64

Hình III.32 a và b. Kết quả phản ứng lai RDB trên mẫu M6 .................................. 65

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................ii

DANH MỤC BẢNG BIỂU...................................................................................iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH......................................................................................v

MỤC LỤC............................................................................................................vii

ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................1

I. TỔNG QUAN...................................................................................................3

I.1. Tổng quan về vi khuẩn gây bệnh đường ruột:..........................................4

I.1.1. Staphylococcus aureus.........................................................................4

I.1.2. Clostridium perfringens.......................................................................5

I.1.3. Clostridium botulinum .........................................................................5

I.1.4. Shigella spp. ........................................................................................6

I.1.5. Vibrio parahaemolyticus......................................................................7

I.1.6. Salmonella spp.....................................................................................8

I.2. Thông tin vùng gen 16S rRNA và 23S rRNA:...........................................9

I.2.1. Vùng gen 16S rRNA.............................................................................9

I.2.2. Vùng gen 23S rRNA........................................................................... 10

I.3. Các phương pháp phát hiện tác nhân vi khuẩn:..................................... 11

I.3.1. Phương pháp nuôi cấy truyền thống................................................... 11

I.3.2. Phương pháp sinh học phân tử hiện đại.............................................. 13

I.4. Các công trình nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử

để phát hiện nhanh, đồng thời vi khuẩn gây bệnh đường ruột: ..................... 201

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................... 22

II.1. Vật liệu:................................................................................................... 23

II.1.1. Các công cụ tin sinh học được sử dụng .............................................. 23

II.1.2. Mẫu thực phẩm trong khảo sát thực nghiệm....................................... 23

II.2. Phương pháp nghiên cứu: ...................................................................... 23

II.2.1. Khảo sát dữ liệu................................................................................. 23

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 2015

SVTH: DƯƠNG NGỌC HUỲNH viii

II.2.2. Khảo sát in silico ............................................................................... 24

II.2.3. Khảo sát thực nghiệm ........................................................................ 25

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................... 33

III.1. Thu thập dữ liệu:..................................................................................... 34

III.2. Kết quả khảo sát in silico......................................................................... 36

III.2.1. Thu thập trình tự gen 16S rRNA và 23S rRNA của các loài vi khuẩn .. 36

III.2.2. Thu thập và đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò .......................................... 36

III.2.3. Khảo sát bộ mồi phổ quát .................................................................. 38

III.2.4. Khảo sát bộ mẫu dò ........................................................................... 47

III.3. Kết quả thực nghiệm:.............................................................................. 57

III.3.1. Kết quả tách chiết DNA vi khuẩn và đo OD....................................... 58

III.3.2. Kết quả điện sản phẩm PCR............................................................... 59

III.3.3. Kết quả lai RDB ................................................................................ 60

III.3.4. Kết quả xác định mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu:............... 66

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................. 69

IV.1. Kết luận ................................................................................................... 70

IV.2. Đề nghị .................................................................................................... 70

V. TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 72

VI. PHỤ LỤC..........................................................................................................79