Biểu hiện, tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ chế tạo kít phát hiện nhanh độc tố seb trong thực phẩm và môi trường

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN BÍCH LOAN

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP

STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ

CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB

TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN BÍCH LOAN

BIỂU HIỆN, TINH SẠCH KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP

STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC VỤ

CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ SEB

TRONG THỰC PHẨM VÀ MÔI TRƢỜNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGHIÊM NGỌC MINH

Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng

sự nghiên cứu phòng Công nghệ sinh học Môi trường - Viện Công nghệ sinh

học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 06

năm 2012 tới tháng 06 năm 2013.

Tác giả

Nguyễn Bích Loan

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới

PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường

- Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa

chất thiết bị trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phòng.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới KS. Nguyễn Thị Hoài Thu và các

anh chị, cán bộ phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh

học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi

hoàn thành luận văn này.

Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy

cô giáo trong nhà trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên; các thầy

cô Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè

những người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình

học tập và thực hiện luận văn này.

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013

Học viên

Nguyễn Bích Loan

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................i

LỜI CẢM ƠN..................................................................................................ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................. vi

DANH MỤC BẢNG.....................................................................................viii

DANH MỤC HÌNH........................................................................................ix

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3

1.1. Tình hình ngộ độc thực phẩm................................................................. 3

1.1.1. Tình hình nhiễm độc thực phẩm chung .......................................... 3

1.1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố

ruột Staphylococal enterotoxin B trên thế giới và Việt Nam............................ 5

1.2. Một vài nét về tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................... 8

1.2.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................... 8

1.2.2. Đặc điểm phân loại.......................................................................... 9

1.2.3. Tính chất và phân bố..................................................................... 11

1.2.4. Đặc điểm hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus.................. 12

1.2.5. Độc tố và khả năng gây bệnh........................................................ 12

1.3. Nội độc tố ruột Staphyloccoccal enterotoxin B ................................... 16

1.3.1. Đặc điểm cấu trúc.......................................................................... 16

1.3.2. Cơ chế gây bệnh............................................................................ 18

1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng. 19

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 22

2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.................................... 22

2.1.1. Đối tượng thí nghiệm.................................................................... 22

2.1.2. Chủng vi khuẩn và plasmid........................................................... 22

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

iv

2.1.3. Các bộ kit ...................................................................................... 22

2.1.4. Hóa chất, máy móc và thiết bị....................................................... 22

2.1.5. Môi trường và đệm........................................................................ 23

2.1.6. Phần mềm...................................................................................... 23

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 23

2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................... 23

2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu ....................................................... 24

2.2.2.1. Phương pháp biến nạp vào tế bào khả biến Escherichia coli

BL21(DE3)...................................................................................................... 24

2.2.2.2. Phương pháp tách DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli

BL21(DE3)...................................................................................................... 25

2.2.2.3 Phương pháp xử lý enzym hạn chế ............................................. 26

2.2.2.4. Biểu hiện protein Staphyloccoccal enterotoxin B trong tế bào vi

khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3)..................................................... 27

2.2.2.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide ........................... 28

2.2.2.6. Phương pháp sạc cột Ni - NTA.................................................. 31

2.2.2.7. Phương pháp tinh sạch protein................................................... 32

2.2.2.8. Định lượng protein theo phương pháp Bradford........................ 33

2.2.2.9. Phương pháp kiểm tra độc tính của protein SEB đột biến......... 35

2.2.2.10. Phương pháp gây miễn dịch trên chuột.................................... 38

2.2.2.11. Phương pháp Western blot ....................................................... 39

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................... 41

3.1. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protein tái tổ hợp

Staphylococcal enterotoxin B.......................................................................... 41

3.1.1. Biến nạ pET21a+ mang gen seb vào chủng E. coli

......................................................................................................................... 41

3.1.2. Nghiên cứu biểu hiện gen seb với các điều kiện tối ưu ................ 44

3.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp.................................................................. 46

3.3. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford ............................... 48

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

v

3.4. Kiểm tra độc tính của protein............................................................... 50

3.4.1. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến

(SEB2) ở liều tiêm 1xLD50 ............................................................................ 51

3.4.2. Đánh giá độc tính giữa SEB tự nhiên (SEB1) và SEB đột biến

(SEB2) ở liều tiêm 3xLD50 và 10xLD50....................................................... 51

3.5.Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của kháng

nguyên Staphylococcal enterotoxin B ......................................................... 54

3.5.1.Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C..................................... 54

3.5.2.Kết quả kiểm tra khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên chuột của

kháng nguyên .................................................................................................. 54

KẾT LUẬN .................................................................................................... 58

KIẾN NGHỊ................................................................................................... 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 60

Tài liệu Tiếng Việt........................................................................... 60

Tài liệu Tiếng Anh .......................................................................... 61

Tài liệu internet............................................................................... 65