Xây dựng dữ liệu DNA Barcode cho một số mẫu nấm thuộc chi Metacordyceps, họ Clavicipitaceae, thu nhận tại Langbiang, Lâm Đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

LÊ CÔNG HẠC

XÂY DỰNG DỮ LIỆU DNA BARCODE

CHO MỘT SỐ MẪU NẤM THUỘC CHI

METACORDYCEPS, HỌ CLAVICIPITACEAE,

THU NHẬN TẠI LANGBIANG, LÂM ĐỒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

LÊ CÔNG HẠC

XÂY DỰNG DỮ LIỆU DNA BARCODE

CHO MỘT SỐ MẪU NẤM THUỘC CHI

METACORDYCEPS, HỌ CLAVICIPITACEAE,

THU NHẬN TẠI LANGBIANG, LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : GS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là: Lê Công Hạc

Ngày sinh: 16/06/1988 Nơi sinh: Quảng Ngãi

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã học viên: 1984202012001

Tôi đồng ý cung cấp toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho

Thư viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở

Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối toàn văn thông tin luận văn tốt nghiệp vào hệ thống

thông tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

Lê Công Hạc

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Xây dựng dữ liệu DNA Barcode cho một số

mẫu nấm thuộc chi Metacordyceps, họ Clavicipitaceae, thu nhận tại

Langbiang, Lâm Đồng” là bài nghiên cứu của chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam

đoan rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được

công bố hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận

văn này mà không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các

trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP.Hồ Chí Minh, Năm 2022

Lê Công Hạc

ii

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn GS. Lê Huyền Ái Thúy đã tận tình giảng

dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cần thiết và hết lòng hướng dẫn, hỗ trợ

em trong quá trình ��c hiện luận văn này.

Em xin cảm ơn TS. Lao Đức Thuận đã hướng dẫn, hỗ trợ, chỉ bảo em không chỉ

những kiến thức chuyên môn, tinh thần nghiên cứu nghiêm túc và làm việc hiệu

quả cùng nhiều kinh nghiệm sống trong suốt quá trình ��c hiện luận văn.

Em xin cảm ơn các anh chị học viên, các bạn đã giúp đỡ em trong suốt quá trình

học và hoàn thành luận văn.

Em xin cảm ơn Quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học và Quý Thầy Cô khoa

Đào Tạo Sau Đại Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình

dạy bảo cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã

tạo điều kiện cho em có cơ hội được học tập, ��c hiện và hoàn thành luận văn.

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cha mẹ đã

nuôi dưỡng, dạy bảo để con có được ngày hôm nay. Xin cảm ơn anh chị em

trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và hoàn thành

luận văn.

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

iii

TÓM TẮT

DL0091, DL106 là hai mẫu nấm ký sinh trên ấu trùng của côn trùng bộ cánh

vẩy (Lepidoptera) đã được thu thập tại khu �� trữ sinh quyển Lang Biang thuộc tỉnh

Lâm Đồng, Việt Nam. Từ các thành phần hóa học của mẫu nấm DL0091, DL106

đặc biệt trong đó có chứa adenosine và cordycepsin chứng tỏ đây là một trong

những chủng giống nấm địa phương có tiềm năng ứng dụng cao trong y dược cũng

như ��c phẩm chức năng. Các phân tích so sánh hình thái giải phẫu đã cho thấy

mẫu DL0091 là loài nấm Metacordyceps neogunnii (chi Metacordyceps, họ

Clavicipitaceae). Mẫu nấm này có nhiều đặc điểm hình thái tương đồng với loài

Metacordyceps neogunnii T.C. Wen & K.D. Hyde. So sánh với loài Cordyceps

gunnii (Berk.) Berk., (một loài thường bị nhầm lẫn với loài M. neogunnii T.C. Wen

& K.D. Hyde), thì mẫu DL0091 có một số đặc điểm khác biệt khá rõ ràng như: quả

thể có kích thước lớn hơn (15–130 mm x 2–6 mm), túi bào tử cũng có kích thước

lớn hơn (550–680 μm × 5–8 μm). Mẫu DL106 là loài nấm Metacordyceps

indigotica (chi Metacordyceps, họ Clavicipitaceae). Kích thước có thể lên tới 20cm

(bao gồm cả ký chủ). Khi non, toàn bộ quả thể có màu vàng, khi trưởng thành phần

sinh sản chuyển dần sang màu xám. Phần sinh sản phình to so với cuống, phát triển

tại đầu tận cùng của quả thể, có dạng chùy, tách biệt khá rõ với phần cuống, kích

thước 5-7mm × 40-60mm. Cuống nấm dạng sợi, phần nhô lên khỏi giá thể có màu

xám đậm, phần không tiếp xúc ánh sáng có màu vàng; kích thước 2-3mm × 70-

100mm, thường có 1 số bó sợi nhỏ (tương �� cuống nấm) màu vàng phát sinh từ

phần đầu của ký chủ. Chén dạng elip kéo dài, miệng chén nhô cao, màu xám đen,

xếp xiên góc so với trục quả thể, kích thước 300-340µm × 935-1010 µm, túi dạng

sợi, có nắp đậy, kích thước 3,9-5,2 µm × 234-312µm; bào tử túi thường không tách

khỏi chuỗi sau khi giải phóng ra khỏi túi. Tuy nhiên, các �� liệu phân tử hướng tới

định danh bằng DNA barcode vẫn chưa được nghiên cứu. Do đó, trong nghiên cứu

này, các gene ITS, Tef, nrLSU, nrSSU và Rpb1 được tiến hành phân tích nhằm xây

��ng bộ dữ liệu DNA barcode để hỗ trợ định danh các loài thuộc chi này.

iv

ABSTRACT

Two specimens of DL0091 and DL106, parasitized on the larva of

Lepidoptera, were collected from Lang Biang Biosphere Reserve, located in Lam

Dong Province, Vietnam. Because both of them contain many bioactive

components, especially Adenosine and Cordycepin, they are promised to be a local

precious natural source of medicine and function food for health care. Based on

classification, DL0091 and DL106 were identified as Metacordyceps neogunnii

(Metacordyceps, Clavicipitaceae) and as Metacordyceps indigotica

(Metacordyceps, Clavicipitaceae). DL0091 shares the similar characteristics of M.

neogunnii T.C. Wen & K.D. Hyde. Its morphology was differed from Cordyceps

neogunnii (Berk.) Berk., by many characteristics, such as: the larger stroma of

DL0091 (15–130 mm x 2–6 mm), of asci (550–680 μm × 5–8 μm), etc. The

characteristics of DL106 were identified: Size can be up to 20 cm (including host).

When young, the whole fruit body is yellow, when mature, the reproductive part

turns gray. The reproductive part is enlarged relative to the peduncle, developing at

the terminal end of the fruiting body, club-shaped, quite distinct from the peduncle,

5-7nm x 40-60nm in size. Stem filamentous, the part protruding from the substrate

is dark gray, the part not exposed to light is yellow, 2-3mm x 70-100mm in size,

usually with a few bunndles of yellow filaments (similar to mushroom stalks) arsing

from the head of the host. Elongated elliptical cup, raised mouth, dark gray color,

arranged at an angle to the fruit body axis, size 300-340 μm x 935-1010 μm.

Felament bag, with lid, size 3.9-5.2 μm x 234-312 μm. The sporangia usually do not

detach from the chain after release from the vesicle. However, molecular data of

thoese samples have not been studied. Therefore, aiming to develop the DNA

barcode for further supporting identification, ITS, Tef, nrLSU, nrSSU and Rpb1

were analysed to establish the data of molecular.

v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i

LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii

TÓM TẮT ................................................................................................................ iii

ABSTRACT .............................................................................................................. iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH ..................................................................................... viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ x

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ...................................................................................... 1

1.1 Cơ sở hình thành luận văn ..................................................................................1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...........................................................................................3

1.3 Câu hỏi - Giả thuyết nghiên cứu .........................................................................3

1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .....................................................................3

1.5 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................3

1.6 Ý nghĩa khoa học v���c tiễn ............................................................................4

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ............................................ 5

2.1 Tổng quan về chi nấm Metacordyceps ...............................................................5

2.1.1 Đặc điểm chung của chi nấm Metacordyceps ...............................................5

2.1.2 Thành phần hóa học ....................................................................................... 7

2.1.3 Tiềm năng ứng dụng của Cordyceps ............................................................. 9

2.2 DNA Barcode và các marker phân tử điển hình trong định danh ngành nấm

Ascomycota ......................................................................................................10

2.2.1 DNA barcode ............................................................................................... 10

2.2.2 Các marker phân tử điển hình trong định danh ngành nấm Ascomycota.... 11

2.3 Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử ...................................................17

2.3.1 Tách chiết và thu nhận DNA ở nấm ............................................................ 17

2.3.2 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................... 18

2.3.3 Phương pháp giải trình �� ............................................................................ 19

2.4 Nghiên cứu định danh và phát sinh loài ...........................................................19

vi

2.4.1 Phương pháp định danh hình thái ................................................................ 19

2.4.2 Phương pháp định danh phân tử ..................................................................20

2.4.3 Nghiên cứu phát sinh loài ............................................................................ 21

2.5 Mẫu nấm sử dụng trong luận văn.....................................................................25

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 29

3.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 29

3.1.1 Bộ mẫu nấm ký sinh côn trùng .................................................................... 29

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị hóa chất ........................................................................ 29

3.2 Các phần mềm và trang web được sử dụng ......................................................31

3.3 Quy trình nghiên cứu ........................................................................................ 33

3.4 Khảo sát mồi khuếch đại gen ............................................................................ 34

3.5 Tiến hành t��c nghiệm.....................................................................................34

3.5.1 Tách chiết DNA ........................................................................................... 34

3.5.2 Kiểm tra mức độ tinh sạch của sản phẩm DNA đã tách chiết .....................35

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 40

4.1 Kết quả khảo sát mồi.........................................................................................40

4.1.1 Kết quả khảo sát insilico các gene định danh phân tử ................................. 40

4.1.2 Kết quả kiểm tra mồi ................................................................................... 42

4.2 Kết quả���c nghiệm.........................................................................................43

4.2.1 Kết quả tách chiết DNA mẫu nấm ký sinh côn trùng..................................43

4.2.2 Kết quả giải trình��.....................................................................................45

4.2.3 Xây ��ng bộ cơ sở dữ liệu DNA .................................................................49

4.2.4 Xây ��ng cây phả hệ phân tử ......................................................................53

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 66

5.1 Kết luận.............................................................................................................66

5.2 Đề nghị..............................................................................................................66

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 67

PHỤ LỤC ................................................................................................................. 74

Phụ lục 1: Kết quả Blast vùng trì��� gene ITS, nrLSU, nrSSU,Tef, Rbp1 của

vii

mẫu DL091 .........................................................................................................74

Phụ lục 2: Kết quả Blast vùng trì��� gene ITS, nrLSU, nrSSU,Tef, Rbp1 của

mẫu DL106 .........................................................................................................75

Phụ lục 3: Kết quả dò tìm mô hình tiến hóa đa gene ITS+ nrLSU+

nrSSU+Tef,+Rbp1 của mẫu DL091...................................................................76

Phụ lục 4: Kết quả dò tìm mô hình tiến hóa đa gene ITS+ nrLSU+

nrSSU+Tef,+Rbp1 của mẫu DL106...................................................................77

Phụ lục 5: Kết quả định danh phân tử đơn gen���a vào trình �� genne Rbp1 và

Tef của mẫu DL091............................................................................................78

Phụ lục 5: Kết quả định danh phân tử đơn gen���a vào trình �� genne ITS và Tef

của mẫu DL106 ..................................................................................................79