Xác định vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò tại một số huyện có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng và bước đầu thử nghiệm a

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÕ TẠI MỘT SỐ

HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG

VÀ BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thái Nguyên, năm 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

XÁC ĐỊNH VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở TRÂU, BÕ TẠI MỘT SỐ

HUYỆN CÓ DỊCH TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH CAO BẰNG

VÀ BƢỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM AUTO-VACCINE

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60.62.50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Đặng Xuân Bình

Thái Nguyên, năm 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện

cùng với sự giúp đỡ của TS. Đặng Xuân Bình. Các số liệu, hình ảnh và kết quả

trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công

trình nào khác. Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã

được chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Kim Dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã luôn

nhận được sự giúp đỡ quý báu, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo trong

suốt quá trình thực hiện đề tài.

Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với

thầy: T.S Đặng Xuân Bình người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình

nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm

Thái Nguyên, tập thể cán bộ nghiên cứu của Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Viện

Khoa học Sự sống, tập thể lãnh đạo và cán bộ Chi cục Thú y tỉnh Cao Bằng cùng

gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ tôi

trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Thái Nguyên, ngày ... tháng ... năm 2010

Nguyễn Thị Kim Dung

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU..........................................................................................................1

1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................2

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................2

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................3

1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trong và ngoài nước...............3

1.1.1. Trên thế giới .....................................................................................3

1.1.2. Ở Việt Nam.......................................................................................4

1.2. Đặc điểm dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng ...............................................5

1.3. Mầm bệnh .............................................................................................10

1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu ......................................11

1.3.2. Đặc tính nuôi cấy.........................................................................12

1.3.3. Đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Pasteurella multocida.................15

1.3.4. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida........16

1.3.5. Serotype của vi khuẩn P. multocida.............................................18

1.3.6. Độc lực của vi khuẩn P. multocida ..............................................21

1.3.7. Sức đề kháng ...............................................................................22

1.4. Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P. multocida gây nên .........................23

1.4.1. Cơ chế sinh bệnh.............................................................................23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.4.2. Biểu hiện đặ c trưng của trâu bò mắc bệnh tụ huyết trùng ................23

1.5. Những hiểu biết về vắc xin phòng bệnh ................................................25

1.5.1. Một vài nét về lịch sử phát triển của vắc xin ...................................25

1.5.2. Thành phần của vắc xin ..................................................................26

1.5.3. Công nghệ lên men vi khuẩn trong chế tạo vắc xin .........................30

1.5.4. Phân loại vắc xin.............................................................................30

1.5.5. Vắc xin tại chỗ (autovaccine)..........................................................33

Chƣơng 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................34

2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu.........................................34

2.1.1. Đối tượng........................................................................................34

2.1.2. Thời gian và địa điểm .....................................................................34

2.2. Nội dung nghiên cứu.............................................................................34

2.2.1. Điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao

Bằng .........................................................................................................34

2.2.2. Phân lập vi khuẩn P. multocida từ dịch ngoáy mũi gia súc khoẻ .....34

2.2.3. Chế tạo vắc xin tại chỗ phòng bệnh tụ huyết trùng..........................35

2.3. Vật liệu dùng cho nghiên cứu................................................................35

2.3.1. Mẫu dùng phân lập vi khuẩn ..........................................................35

2.3.2. Động vật thí nghiệm .......................................................................35

2.3.3. Hóa chất và dụ ng cụ nghiên cứu .....................................................35

2.3.3.1. Hoá chất dùng để nhuộm Gram ................................................35

2.3.3.2. Hoá chất dùng để thử phản ứng sinh hoá ..................................35

2.3.4. Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ..........................................36

2.3.5. Dụng cụ thí nghiệm ........................................................................36

2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................36

2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ...........................................................36

2.4.2. Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P. multocida ...37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.4.2.1. Nuôi cấy, phân lập ....................................................................37

2.4.2.2. Phương pháp xác định các đặc tính sinh vật, hóa học................38

2.4.3. Phương pháp thử độ c lự c trên chuộ t nhắt trắng ...............................41

2.4.4. Phương pháp thử kháng sinh đồ ......................................................42

2.4.5. Chế tạo vắc xin tại chỗ theo tiêu chuẩn ngành.................................42

2.4.5.1. Phương pháp tính LD50 của P. multocida trên chuột .................42

2.4.5.2. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn .................................43

2.4.5.3. Phương pháp chế tạo vắc xin ....................................................43

2.4.6. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................45

Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.........................................................46

3.1. Kết quả khảo sát tình hình bệnh tụ huyết trùng gia súc tại Cao Bằng

từ năm 2006 – 2009 .....................................................................................46

3.1.1. Tình hình bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ năm 2006 – 2009....47

3.1.2. Tần suất xuất hiện dịch bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Cao Bằng từ

năm 2006 – 2009 ......................................................................................48

3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng ở các mùa vụ.......50

3.1.4. Triệu chứng đặc trưng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng ..............53

3.1.5. Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi gia

súc khoẻ tại tỉnh Cao Bằng .......................................................................54

3.1.6. Tỷ lệ mang trùng Pasteurella multocida của trâu, bò khỏe tại ổ dịch

theo lứa tuổi...............................................................................................56

3.1.7. Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật – hoá học của các

chủng vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được tại một số huyện

có dịch trên địa bàn tỉnh Cao Bằng ...........................................................58

3.1.8. Xác định type giáp mô của vi khuẩn P. multocida bằng phương

pháp PCR (Polymerase chain reaction).....................................................59

3.1.9. Kết quả xác định độc lực của các chủng P. multocida phân lập được.....59

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.1.10. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được với một số loại kháng sinh ................................61

3.2. Nghiên cứu chế tạo vắc xin tụ huyết trùng trâu, bò................................62

3.2.1. Chọn chủng vi khuẩn P. multocida sản xuất vắc xin .......................62

3.2.2. Xác định liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50).....................64

3.2.3. Kết quả chế tạo và kiểm nghiệm autovaccine..................................65

3.2.4. Kiểm tra an toàn và hiệu lực của autovaccine trên động vật thí nghiệm...66

3.2.5. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine ..................................................68

3.2.5.1. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 1 và 2 năm tuổi...68

3.2.5.2. Thử nghiệm lâm sàng autovaccine ở trâu, bò 3 năm tuổi ..........68

3.2.6. Theo dõi sự biến động về chỉ tiêu thân nhiệt và tần số hô hấp ở

trâu, bò sau khi tiêm autovaccine ..............................................................71

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...........................................................................74

1. Kết luận ...................................................................................................74

2. Đề nghị ....................................................................................................75

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN......................76

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................77

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHI: Brain Heart Infusion

Cs: Cộng sự

DNA: Deoxyribonucleic Acid

ĐC: Đối chứng

FAO: Food and Agriculture Oganization

LD50: Lethal Dose 50 - Liều gây chết 50%

MR: Methyl Red

PCR: Polymerase Chain Reaction

P. multocida: Pasteurella multocida

TN: Thí nghiệm

VP: Voges Proskauer

YPC: Yeast extract Pepton - L - Cystin

370C/24h : Bồi dưỡng trong tủ ấm 370C trong 24 giờ

+ Chú thích

CB6: Mẫu nghiên cứu số 6 tại Cao Bằng