Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRONG THỊT

BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT

KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU

PHẠM THỊ TÂM

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC THÚ Y

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm ở Việt Nam đang được Chính phủ và

hầu hết các Ngành, các cấp và người tiêu dùng quan tâm. Gần đây báo chí

thường xuyên lên tiếng phản đối việc sử dụng hormone, kháng sinh, thuốc

bảo vệ thực vật không đúng mục đích và không phù hợp với các qui định, gây

ảnh hưởng nguy hiểm đến sức khoẻ con người. Việc phát hiện thấy chất sudan

trong lòng đỏ trứng gà, melamin trong sữa, kim loại nặng gấp nhiều lần so với

ngưỡng quy định là những hồi chuông cảnh báo cho sự mất an toàn của thực

phẩm đang lưu hành tại Việt Nam. Theo số liệu thống kê của Cục Vệ sinh An

toàn Thực phẩm – Bộ Y Tế, năm 2010 cả nước đã xảy ra 132 vụ ngộ độc thực

phẩm với 4.676 người mắc bệnh, 3.281 người nhập viện và có 41 trường hợp

tử vong. Nguyên nhân chính là do vi khuẩn (Salmonella, Streptoccocus, E.

coli Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và hóa chất) [2].

E.coli O15:H7 là một trong các chủng vi khuẩn nguy hiểm gây ngộ độc

thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới với các hội chứng: tiêu chảy, viêm

ruột xuất huyết, urê huyết (Haemolytic ureamic syndrome-HUS). Thịt bò và

các sản phẩm chế biến từ bò là những loại thực phẩm có nguy cơ cao nhiễm

vi khuẩn E.coli O15:H7. Theo báo cáo của Griffin P.M, (1995) [47], 3,7%

mẫu thịt bò ở vùng Nam Mỹ nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7. Ở Châu Á,

E.coli O157:H7 đã được phát hiện ở Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia

(Yamada, 1993) [144], (Son Radu, 1998) [133]. Ở Việt Nam, vi khuẩn này

được phát hiện thấy trong phân bò với tỷ lệ 2% (Norobu và cộng sự, 2005)

[90]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu của các tác giả trong nước đã phát hiện

thấy các gen độc tố điển hình của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong thịt bò, thịt

lợn, phân bò, phân lợn với tỷ lệ mẫu nhiễm khá cao (Phạm Công Hoạt và

cộng sự, 2003) [3], (Trần Thanh Phong và cộng sự, 2007) [5].

2

Như vậy, với điều kiện chăn nuôi kém vệ sinh và đặc biệt là điều kiện

giết mổ mất vệ sinh, thiếu kiểm soát như hiện nay ở Việt Nam thì nguy cơ

nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 vào các loại thực phẩm và gây ngộ độc thực

phẩm cho người tiêu dùng là rất dễ xảy ra.

Với mục đích xác định sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò để chủ

động trong công tác phòng, điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm và sản xuất

kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit xác định nhanh vi khuẩn, chúng tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7

trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất

kháng thể đơn đòng đặc hiệu”.

2. Mục tiêu của đề tài

- Xác định được tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 trong thịt bò bán ở một số

địa điểm tại Hà Nội;

- Sản xuất được kháng thể đơn dòng đặc hiệu của vi khuẩn E.coli

O157:H7.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Việc xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 và các đặc

tính sinh hóa cũng như độc lực của vi khuẩn này sẽ là cơ sở để xác định dịch

tễ học của hội chứng ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn này gây ra, từ đó tạo cơ

sở để xây dựng các biện pháp phòng ngừa quá trình ô nhiễm thực phẩm và

điều trị bệnh do vi khuẩn này gây nên.

- Đề tài đã đưa ra được quy trình chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu

với vi khuẩn E.coli O157:H7 có thể ứng dụng để sản xuất các kit chẩn đoán

huyết thanh học xác định vi khuẩn này.

3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề tài đã xác định được sự có mặt của vi khuẩn E.coli O157:H7 trong

thịt bò bán ở Hà Nội và một số vùng phụ cận, đồng thời chứng minh được

khả năng gây bệnh của các chủng này.

- Đề tài đã chế tạo được 2 kháng thể đơn dòng đặc hiệu 100% với vi

khuẩn E.coli O157:H7. Hai kháng thể này đã được sử dụng trong nghiên cứu

tạo phức hợp kháng thể và hạt nano silica để phát hiện số lượng vi khuẩn

E.coli O157:H7 do Viện Công nghệ sinh học chủ trì thực hiện.

- Việc xác định được vi khuẩn E.coli O157:H7 và sản xuất kháng thể

đơn dòng phục vụ chế tạo kit phát hiện vi khuẩn sẽ góp phần tích cực trong

công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.

4. Những đóng góp mới của đề tài

Kết quả của đề tài hoàn toàn mới ở Việt Nam, với các lý do:

- Đề tài được thực hiện với đối tượng là vi khuẩn E.coli O157:H7

nhiễm trong thịt bò và đặc tính gây điển hình. Kết quả của đề tài là minh

chứng đầu tiên cho sự có mặt của vi khuẩn này trong thịt bò ở Hà Nội và các

vùng phụ cận.

- Lần đầu tiên ở Việt Nam chế tạo được kháng thể đơn dòng đặc hiệu

của vi khuẩn E.coli O157:H7 để ứng dụng vào quy trình xác định vi khuẩn

trong thực phẩm và chẩn đoán cho bệnh nhân ngộ độc thực phẩm.

4

Ch−¬ng I. Tæng quan tµi liÖu

1.1 Vi khuÈn E.coli g©y bÖnh

Escherichia coli (E.coli) là vi khuẩn thường trú trong đường ruột của

người và động vật máu nóng. Hầu hết các chủng E.coli là vô hại. Tuy nhiên,

do sự suy giảm miễn dịch hoặc có sự tổn thương ở niêm mạc đường tiêu hoá

mà ngay cả các chủng E.coli thông thường cũng có thể gây bệnh. Với các

chủng gây bệnh, vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua bề mặt màng

nhày niêm mạc hoặc da và gây nên 3 hội chứng lâm sàng chủ yếu, bao gồm: i)

nhiễm khuẩn đường tiết niệu, ii) nhiễm trùng huyết hoặc viêm màng não, và

iii) viêm ruột, tiêu chảy.

Theo thống kê của James Nataro và cộng sự, (1998) [53], các chủng vi

khuẩn E.coli gây bệnh được chia thành 5 nhóm ( phụ lục bảng 1).

+ Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các chủng E.coli gây

viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi (Polotsky và cộng sự, 1977) [106].

+ Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gồm các chủng E.coli tiết ra 2

độc tố ruột bền nhiệt (heat stable toxin- ST) và độc tố ruột không bền nhiệt

(heat-labile enterotoxin- LT). Trong ®ã, độc tố LT hoạt hóa men adenyl

cyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’

monophosphat). Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl-

và bicarbonat tách ra khỏi tế

bào đồng thời ức chế Na+ bên trong tế bào, gây hiện tượng kéo nước từ tế bào,

mô vào lòng ống tiêu hóa và hậu quả là gây tiêu chảy mất nước. Còn độc tố

ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’

monophosphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước gây

ra tiêu chảy. Những chñng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra

tiêu chảy trầm trọng và kéo dài (Levine và cộng sự, 1987) [70].

5

+ Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những chñng E.coli này bám

lên niêm mạc và làm bong tróc gây loét niêm mạc do đó gây tiêu chảy lẫn

máu (giống triệu chứng bệnh lỵ do vi khuẩn Shigella) (DuPont và cộng sự,

1971) [35].

+ Nhóm EAEC (Enteroaggregative E.coli): là nhóm E.coli gây tiêu

chảy nhưng không sản sinh độc tố (Cravioto và cộng sự, 1979) [29].

+ Nhóm EHEC: là nhóm E.coli gây tiêu chảy xuất huyết, đại diện là vi

khuẩn E.coli O157: H7. Vi khuẩn này gây bệnh ở người với các triệu chứng

cấp tính như: tiêu chảy cấp, xuất huyết đường tiêu hoá, phân có lẫn máu, gây

hội chứng ure huyết (HUS-Haemolytic Uraemic Syndrome), trường hợp

nghiêm trọng có thể gây tử vong. 85-95% các ca bệnh nhiễm E.coli O157:H7

là có biểu hiện hội chứng urê huyết (Riley và cộng sự, 1983) [119].

E.coli O157:H7 là vi khuẩn duy nhất thuộc loài E.coli duy nhất gây ngộ

độc thực phẩm ở người. Theo ước tính của CDC, (1999) [26], hàng năm số ca

nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 tại nước này chiếm khoảng 20.000 người,

trong đó, khoảng 250 trường hợp tử vong. Nguyên nhân của tình trạng ngộ

độc này là do E.coli O157:H7 nhiễm trong nước uống, rau xanh, thịt bò và

các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ bò.

Theo các tác giả Faith và cộng sự, (1996) [39], Hancock và cộng sự,

(1994) [48], tỷ lệ E. coli O157:H7 trên gia súc non lớn hơn ở gia súc trưởng

thành. Còn theo nghiên cứu của Doyle và cộng sự, (1997) [34] cho biết: E.

coli O157:H7 có mặt trong 3,7% mẫu thịt bò bán lẻ, 1,5% mẫu thịt lợn, 1,5%

mẫu thịt gà, 2% mẫu thịt cừu. Bên cạnh đó, các nghiên cứu khác của Le Saux

và cộng sự, (1993) [68], cũng chứng minh rằng vi khuẩn E. coli O157:H7

nhiễm trong thịt bò tái, sữa tươi và bánh humburger là nguyên nhân gây nhiều

vụ ngộ độc thực phẩm ở Mỹ và Canada. Ngoài ra, người ta cũng đã xác định

được sự có mặt của vi khuẩn này ở sốt mayonaire (Griffin, 1995) [47], nước

6

hoa quả chưa thanh trùng (Besser và cộng sự, 1993) [14], (Mc Carthy, 1996)

[78] và rau sống (Morgan, 1988) [83].

Ở Việt Nam, mặc dù chưa có báo cáo về số trường hợp ngộ độc thực

phẩm do E.coli O157:H7, tuy nhiên, theo báo cáo của Noboru và cộng sự,

(2005) [90], 2/100 mẫu phân bò nuôi tại Việt Nam có mặt vi khuẩn này. Theo

một số các nghiên cứu ở trong nước của tác giả như: Phạm Công Hoạt và

cộng sự, (2003) [3] đã xác định được 8/33 mẫu phân lợn tiêu chảy nhiễm độc

tố Stx của vi khuẩn E.coli O157:H7. Còn trong nghiên cứu của tác giả Trần

Thanh Phong và cộng sự, (2007) [5], các gen độc tố đặc trưng của vi khuẩn

E.coli O157:H7 như Stx1, Stx2, eae, hly, stb được phát hiện thấy trong thịt bò,

thịt lợn, phân bò, phân lợn bình thường và tiêu chảy với tỷ lệ tương đối cao,

cụ thể: có tới 50% mẫu phân bê tiêu chảy, 57,1% mẫu phân bò bình thường,

55,9% mẫu thịt bò mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC; còn

trên lợn thì có đến 33,3% mẫu phân lợn con tiêu chảy, 62,5% mẫu phân lợn

con cai sữa tiêu chảy, 20% mẫu phân lợn bình thường, 24,5% mẫu thịt lợn

mang 1 đến 8 gen độc lực đặc trưng của nhóm EHEC.

1.2 Các đặc tính của vi khuẩn E.coli O157:H7

1.2.1 Đặc tính sinh học

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái

E.coli O157: H7 là trực khuẩn hình que ngắn, bắt màu gram âm, kích

thước tế bào khoảng 2x0,5µm, không hình thành nha bào, có lông và roi, có

khả năng di động. Khuẩn lạc vi khuẩn dạng S, tròn trơn, bóng, có lớp màng

bao bọc, gắn chặt trên bề mặt môi trường thạch, khuẩn lạc có màu nâu nhạt

trên môi trường thạch Sorbitol MacConkey(SMAC).

1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

7

Khác với hầu hết các chủng E.coli khác, E.coli O157:H7 không lên

men đường D-sorbitol, do đó, môi trường thạch Sorbitol MacKonkey được sử

dụng làm môi trường đặc hiệu để phân biệt vi khuẩn này (March và cộng sự,

1986) [77]. Trên môi trường SMAC, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng

nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen.

Theo Thompson, (1990) [139], E.coli O157:H7 không sinh enzyme β￾glucuronidase, do đó trên môi trường có bổ sung cơ chất 4-

methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG), vi khuẩn này không phát quang,

trong khi các vi khuẩn E.coli khác lại có khả năng đó. Vì vậy, người ta có thể

phân biệt được khuẩn lạc E.coli O157:H7 trên môi trường thạch MUG dưới

ánh sáng tử ngoại.

Ngoài ra, khuẩn lạc E.coli O157:H7 có thể phân biệt được trên môi

trường Rainbow Agar O157 (Biolog Inc., Mỹ) hoặc Fluorocult E.coli O157

(Merck, Đức). Trên môi trường thạch Fluorocult® khuẩn lạc của vi khuẩn này

có màu xanh nhạt trong khi các E.coli khác có màu vàng. Còn trên môi trường

thạch Rainbow, khuẩn lạc vi khuẩn E.coli O157 có phổ màu đen, xám, đỏ,

xanh, tím.

1.2.1.3 Sức đề kháng

+ Nhiệt độ: khả năng thích ứng với nhiệt độ của vi khuẩn E.coli nhóm

EHEC, bao gồm cả chủng E.coli O157:H7 tương tự với các nhóm khác. Theo

Doyle và cộng sự, (1984) [32], chủng vi khuẩn này bị ức chế ở điều kiện trên

440C. Tuy nhiên, Palumbo và cộng sự, (1995) [99] lại cho biết, khả năng thích

ứng với nhiệt độ của E.coli O157:H7 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy:

trong môi trường BHI (Brain Heart Infusion), vi khuẩn này vẫn phát triển tốt

ở nhiệt độ 450C, còn với môi trường EC (E.coli) thì chúng lại bị ức chế ở

nhiệt độ 440C. Theo Buchanan và cộng sự, (1994) [21], Rajkowski và cộng

8

sự, (1995) [108], nhiệt độ tối thiểu cho sự sinh trưởng của vi khuẩn E.coli

O157:H7 là khoảng 8-100C.

+ Độ pH: theo Buchanan và cộng sự, (1992) [20], pH thích hợp cho vi

khuẩn E.coli O157:H7 là 5,5-7,5. Vi khuẩn này bị ức chế mạnh ở mức pH

4,0-4,5, tuy nhiên ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của vi khuẩn còn phụ

thuộc vào các yếu tố có liên quan khác như: thời gian, nhiệt độ nuôi cấy, loại

axit, nồng độ axit sử dụng để chuẩn độ môi trường (Leyer và cộng sự, 1995)

[71]. Còn theo nghiên cứu của Benjamin và cộng sự, (1995) [13], Buchanan

và cộng sự, (1996) [22], các chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC có khả năng

chịu được độ pH 2,5 trong 2-7 giờ ở 370C. Trong các loại thực phẩm lên men

như nước ép trái cây, pho mát, E.coli O157:H7 có thể tồn tại sau vài tháng.

Tuy nhiên, khả năng sống sót của vi khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào thời gian

bảo quản, ví dụ: trong nước ép hoa quả vi khuẩn có thể tồn tại từ 2-3 ngày ở

250C, nhưng ở 80C, vi khuẩn chỉ tồn tại từ 10-30 ngày (Zhao và cộng sự,

1993) [148].

+ Khả năng chịu mặn: theo Buchanan và cộng sự, (1994) [22], vi

khuẩn E.coli O157:H7 có thể chịu được nồng độ muối từ 0,5-5%.

1.2.2 Đặc tính sinh hoá

Kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 được thực hiện

sau bước nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu SMAC. Các khuẩn lạc

có màu vàng nâu nhạt được cấy chuyển lên môi trường thạch LB (Luria

Agar), sau 18 giờ nuôi cấy ở 420C, thu nhận các khuẩn lạc đứng riêng rẽ để

làm các phản ứng sinh hóa như trong bảng 1.1.

9

Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn E.coli O157:H7 ( Samuel

và cộng sự, 1998) [122]

Phản ứng Kết quả phản ứng

β-Glucuronidase

Sorbitol

Salicin

Esculin

Arginine dihydrolase

Adonitol

Inositol

Cellobiose

Urease

Citrate

KCN

Sucrose

Glucose (acid)

Glucose (gas)

Indol

Arabinose

Trehalose

Mannitol

Lactose

Maltose

Rhamnose

Xylose

Lysine decarboxylase

Ornithine decarboxylase

Raffinose

Dulcitol

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính

10

Phản ứng không lên men đường D-sorbitol được thực hiện trên môi

trường SMAC. Trên môi trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng

nâu nhạt trong khi các chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen.

Phản ứng âm tính β-glucuronidase của vi khuẩn E.coli O157:H7 được

thực hiện với môi trường có bổ sung cơ chất 4-methylumbelliferyl-β-D￾glucuronide (MUG). Vi khuẩn này không sản sinh enzyme β-glucuronidase

vì vậy không thủy phân 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide thành 4-

methylumbelliferone và glucuronide vì vậy khi quan sát khuẩn lạc vi khuẩn

E.coli O157:H7 dưới ánh sáng đèn tử ngoại, ta không nhìn thấy hiện tượng

phát quang do 4-methylumbelliferone.

Các phản ứng lên men đường lactose, glucose, sinh H2S và sinh hơi

được thực hiện trên môi trường thạch KIA (Kligler Iron Agar). Trên môi

trường này, vi khuẩn E.coli O157:H7 gây hiện tượng lên men đường lactose

tạo nên màu vàng ở phần thạch nghiêng, lên men đường glucose tạo màu

vàng ở phần thạch đứng. Vi khuẩn này không sinh H2S nên không tạo màu

đen trong ống thạch.

Phản ứng sinh indol được thực hiện bằng thuốc thử Kovac. Vi khuẩn

E.coli O157:H7 được tăng sinh trong môi trường Tryptone Water Buffer ở

370C trong 20 giờ rồi bổ sung 1ml xylen vào ống canh khuẩn, lắc đều để chiết

tách indol lên lớp dung môi hữa cơ, sau đó nhỏ 1-2 giọt Kovac có chứa p￾dimethylaminobenzaldehyde vào ống canh khuẩn. Vi khuẩn E.coli O157:H7

sản sinh enzyme tryptophanase vì vậy sẽ phân giải tryptophan có trong môi

trường Tryptone Water Buffer để tạo thành indol. Vì vậy, khi nhỏ thuốc thử

Kovac vào canh khuẩn, indol sẽ kết hợp với p-dimethylaminobenzaldehyde

để tạo thành phức hợp có màu đỏ hồng trên bề mặt ống nghiệm.

11

1.2.3 Đặc tính gây bệnh

Bệnh do vi khuẩn E.coli O157:H7 được coi là bệnh truyền lây giữa

người và gia súc. Vi khuẩn này ký sinh trong đường ruột của bò, hươu, cừu vì

vậy nó có thể nhiễm vào tất cả các loại thực phẩm, thức ăn, nước uống có tiếp

xúc với phân nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, E.coli O157:H7 không gây bệnh cho

các loài gia súc này.

Ở người, E.coli O157:H7 là một serotype thuộc loài E.coli có khả năng

gây ngộ độc thực phẩm, xuất huyết và phù thũng ở màng nhầy niêm mạc ruột

(Griffin, 1990) [46]. Các triệu chứng bệnh do vi khuẩn này thường xuất hiện

sau hai ngày nhiễm khuẩn (phụ lục hình 1). Biểu hiện ban đầu ở bệnh nhân

thường không tiêu chảy nhưng có cảm giác đau quặn bụng và sốt nhẹ. Sau

khoảng 24-48 giờ, bệnh nhân tiêu chảy mạnh, đau bụng và mất nước. Trong

một số trường hợp, bệnh nhân xuất hiện hội chứng urê huyết. Sau 1 tuần mắc

bệnh, bệnh nhân có biểu hiện da dẻ nhợt nhạt, xuất huyết các mạch máu ngoại

vi, giảm tiểu cầu, giảm đi tiểu, phù thũng, suy thận cấp (Moake, 1994) [82].

Theo Tarr, (1995) [138], 10% bệnh nhi dưới 10 tuổi có hội chứng urê huyết

(HUS) do vi khuẩn E.coli O157:H7, trong đó, tỷ lệ tử vong là 3 - 5%, khoảng

12- 30% số đó xuất hiện các di chứng suy thận, tăng huyết áp, thần kinh, tiểu

đường, đột quỵ.

1.2.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli O157:H7

1.2.4.1 Độc tố Shiga toxin- Stx

Stx được chia thành 2 loại chính, không gây miễn dịch chéo cho nhau,

đó là Stx1 và Stx2, mỗi chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 mang một hoặc cả hai

loại độc tố này. Trong đó, Stx1 có tính ổn định cao, còn Stx2 được chia thành

nhiều nhóm phụ khác nhau như: Stx2c, Stx2v, Stx2vhb, Stx2e. Stx2e gây phù

thũng chủ yếu trên lợn.

12

Trên thực tế, Stx còn được phát hiện thấy ở các chủng gây bệnh đường

tiêu hoá như: V.cholerae, V.parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, E.coli

K-12, và một số chủng E.coli khác (O’Brien và cộng sự, 1987) [91]. Ở dạng

nguyên mẫu, Stx có trọng lượng phân tử là 78 kDa, chứa 2 tiểu phần A và B,

trong đó, tiểu phần A là một phân tử protein có trọng lượng phân tử là 32 kDa

được phân ly thành 2 chuỗi peptide nhỏ là A1 có trọng lượng 28 kDa (mang

hoạt tính enzyme) và A2 có trọng lượng 4 kDa, hai mảnh peptide này liên kết

với nhau bởi các cầu nối disulfua. Phần B có trọng lượng phân tử là 7,7 kDa

chứa 5 liên kết đặc hiệu với điểm thụ cảm globotriaosylceramide (Gb) trên bề

mặt của tế bào vật chủ. Khi độc tố gắn lên màng tế bào, chúng được thẩm

thấu qua các hốc tế bào rồi đi vào hệ thống golgi và lưới nội chất (Sandvig và

cộng sự, 1994) [123], phần A gắn với tiểu phần 60S của ribosom và ức chế

quá trình tổng hợp protein của tế bào vật chủ (hình 1.1). Kết quả là gây gián

đoạn quá trình tổng hợp protein và gây chết các tế bào biểu mô đường tiết

niệu, đường tiêu hoá hoặc các tế bào có chứa Gb3, Gb4. Loài thỏ không có

yếu tố này trên bề mặt tế bào biểu mô ruột nên vi khuẩn E.coli O157:H7

không gây tiêu chảy và các triệu chứng liên quan tới ngộ độc thực phẩm.

Trong đường tiêu hoá, độc tố Stx có thể gây tổn thương hoặc làm chết

các tế bào lông nhung trên biểu mô ruột (Kandel và cộng sự, 1989) [55],

(Keenan và cộng sự, 1986) [61]. Để chứng minh khả năng gây bệnh đường

tiêu hoá của độc tố Stx, Sjogren và cộng sự, (1994) [130] đã sử dụng chủng vi

khuẩn E.coli RDEC-1 gây bệnh tự nhiên trên thỏ với triệu chứng tiêu chảy

không có máu lai với thực khuẩn thể mang gen Stx cho thỏ uống. Kết quả thí

nghiệm cho thấy, thỏ cho uống chủng vi khuẩn lai có biểu hiện bệnh tích nặng

hơn rất nhiều so với thỏ uống chủng tự nhiên E.coli RDEC-1 với các triệu

chứng như: thay đổi huyết áp, phù thũng, xuất hiện nhiều đám tổn thương trên

niêm mạc đường tiêu hóa.

13

Còn đối với hội chứng urê huyết, các chủng E.coli O157:H7 gây tiêu

chảy lẫn máu thường kèm theo hội chứng này hơn các chủng gây tiêu chảy

thông thường (Griffin, 1995) [47]. Bằng gây nhiễm thực nghiệm tiêm độc tố

Stx1 và Stx2 cho thỏ cho thấy: ở các mô, cơ quan có nhiều điểm thụ cảm Gb3

như ruột non, hệ thần kinh trung ương xuất hiện các đám tổn thương lớn

(Barrett và cộng sự, 1989) [12]. Còn ở thận, do thận thỏ không chứa các điểm

thụ cảm Gb3 nên không xuất hiện tổn thương (Boyd và cộng sự, 1989) [17].

Đối với con người, Gb3 có nhiều trên ống tiết niệu, vì vậy, dưới tác động của

độc tố Stx, các tế bào biểu mô cầu thận căng phồng, tổn thương, có hiện tượng

lắng đọng tiểu cầu, hình thành các sợi tơ trong các tế bào cầu thận (Boyd và

cộng sự, 1989) [17]. Sự tổn thương tế bào biểu mô cầu thận dẫn tới giảm khả

năng lọc của thận, đây chính là nguyên nhân của hội chứng suy thận cấp, biểu

hiện điển hình của HUS. Trên thực tế, Stx2 gây hội chứng urê huyết phổ biến

hơn Stx1 (Boyd và cộng sự, 1989) [17], theo Pickering, (1994) [105] các

chủng E.coli O157:H7 mang độc tố Stx2 thường gây tình trạng HUS mạnh

hơn các chủng chỉ mang độc tố Stx1 hoặc cả hai loại độc tố này.

Hình 1.1 Cấu trúc của độc tố Stx và cơ chế gây bệnh

14

1.2.4.2 Độc tố east1 (eaec)

Theo Savarino và cộng sự, (1996) [124], tất cả các chủng E.coli

O157:H7 đều mang gen eastA mã hoá nên độc tố east1 (phụ lục hình 2). Khả

năng gây bệnh của độc tố này chưa được xác định nhưng độc tố này đã được

tìm thấy trong phân của một số bệnh nhân tiêu chảy.

1.2.4.3 Enterohemolysin (hly)

Ở vi khuẩn E.coli O157:H7, độc tố hly được mã hoá bởi gen nằm trên

plasmid 60 mDa (phụ lục hình 2) (Schmidt và cộng sự, 1995) [127]. Theo

Beutin và cộng sự, (1994) [15], ở Đức, có khoảng 90% chủng E.coli O157:H7

sinh độc tố Stx có mang gen mã hoá độc tố hly. Vai trò của độc tố này vẫn

chưa được xác định rõ, tuy nhiên, khả năng dung giải hồng cầu và giải phóng

heme cùng sắc tố hemoglobin của độc tố này giúp cho E.coli O157:H7 phát

triển tốt hơn trên môi trường thạch máu.

1.2.4.4 Yếu tố bám dính

Yếu tố bám dính của E.coli O157:H7 là OPM intimin có trọng lượng

phân tử từ 94-97 kDa được mã hoá bởi gen eae. Trên lợn con, E. coli

O157:H7 gây tổn thương dạng A/E ở ruột già với đặc điểm bám dính điển

hình của vi khuẩn lên các tế bào biểu mô. Bên cạnh đó, các tác giả Ashkenazi,

(1992) [8], Fratamico, (1993) [43] cũng cho thấy E.coli O157:H7 còn sản sinh

yếu tố bám dính fimbriae, tuy nhiên các tác giả trên chưa xác định được gen

mã hoá yếu tố này.

1.2.4.5 pO157 plasmid

Theo Schmidt và cộng sự, (1994) [126], 1996 [128] hầu hết các chủng

E.coli O157:H7 đều chứa plasmid pO157 có kích thước từ 93.6-104 kb, trên

đó có các gen: gen mã hoá độc tố hly có trọng lượng 3.4 kb, gen mã hóa

enzyme catalase-peroxidase (KatP), enzyme protease phân hủy serine (EspP).