Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÙI THỊ THU HƯƠNG

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ

CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN

VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG

CHỊU NÓNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bùi Thị Thu Hương

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ

CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN

VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG

CHỊU NÓNG

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Mã số: 62 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Trần Bình

Viện Công nghệ sinh học

2. PGS.TS. Trịnh Khắc Quang

Viện Nghiên cứu Rau quả

Hà Nội, 2015

i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng

sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công

bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015

Tác giả

Bùi Thị Thu Hương

ii

Lời cám ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình và PGS.TS. Trịnh

Khắc Quang đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành

công trình nghiên cứu này. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ

Sinh học cùng lãnh đạo, cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ Tế bào thực vật

và phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm

Khoa Học Việt Nam và bộ môn Công nghệ sinh học, viện Nghiên cứu Rau Quả đã

tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, lãnh đạo

và cán bộ thuộc bộ môn Thực vật, khoa Nông học, bộ môn Sinh học, khoa Công

nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện

đề tài.

Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015

Nghiên cứu sinh

Bùi Thị Thu Hương

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

STT Ký hiệu Chữ viết tắt

1 A. rhizogenes Agrobacterium rhizogenes

2 A. rubi Agrobacterium rubi

3 A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

4 ADN Acid Deoxirionucleic

5 AS Acetosyringone

(3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)

6 BA 6-benzyl adenine

7 Bp Base pair

8 CaMV Cailiflower Mosaic Virus

9 Car Carbenicillin

10 Cefo Cefotaxime

11 Chloram Chloramphenicol

12 CodA Choline oxidase

13 CS Cộng sự

14 CT Công thức

15 ĐC Đối chứng

16 E. coli Escherichia coli

17 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

18 Et al Đồng tác giả

19 EtBr Ethidium Bromid

20 GB Glycine betaine

21 Genta Gentamycine

22 GFP Green Fluorescent Protein

23 GUS β-1,4-Glucuronidase

24 Hpt Hygromycine Phosphotransferase

25 HSF Heat shock factor

26 HSPs Heat shock proteins

27 Hygr Hygromycine resistant

iv

STT Ký hiệu Chữ viết tắt

28 ISSR Inter Simple Sequence Repeat

29 Kana Kanamycine

30 LB Luria Bertani

31 M Thang Marker chuẩn

32 MAS Marker assisted selection

33 MDA Malondialdehyde

34 Mm Millimolar

35 MS Murashige and Skoog, 1962

36 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein

37 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β-D-glucoronide

38 µl micro litte

39 µM Micromolar

40 NptII Neomycin Phosphotransferase II

41 PCR Polymerase Chain Reaction

42 Pic Picloram

43 QTL Quantitative trait loci

44 RAPD Random Amplified Polymorphic AND

45 Rifa Rifamycine

POD Peroxidase

46 SOD Superoxide dismutase

47 T-ADN Transfer-ADN

48 TAE Tris-acetate-EDTA

49 Ti-plasmid Tumor inducing Plasmid

50 TP Transit Peptide

51 Vir Virulence

52 WT Dòng không chuyển gen

53 X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucoronide

54 α-NAA 1- Naphthaleneacetic acid

v

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ..............................................................................................................i

Lời cám ơn .................................................................................................................ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ........................................... iii

MỤC LỤC..................................................................................................................v

DANH MỤC BẢNG.............................................................................................. viii

DANH MỤC HÌNH...................................................................................................x

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3

1.1. Tổng quan về cây lily .....................................................................................3

1.1.1. Giới thiệu chung về lily....................................................................................3

1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily ...................................3

1.1.3. Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily.....................4

1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của

cây lily..............................................................................................................5

1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật ...................................................6

1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật........................................................6

1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến cây lily.........................................................8

1.2.3. Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật và lily..................................9

1.3. Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở

thực vật..........................................................................................................15

1.3.1. Giới thiệu chung về glycine betaine ..............................................................15

1.3.2. Chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu cho cây trồng ...............16

1.4. Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công

nghệ gen.........................................................................................................17

1.4.1. Công nghệ tế bào trong tạo giống lily............................................................17

1.4.2. Tình hình ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống lily................................18

vi

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................21

2.1. Vật liệu ..........................................................................................................21

2.1.1. Thực vật...........................................................................................................21

2.1.2. Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng ............................................22

2.1.3. Môi trường nuôi cấy........................................................................................24

2.1.4. Máy móc và thiết bị.........................................................................................25

2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................25

2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong đánh giá vật liệu nghiên cứu......................25

2.2.2. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và

cứu phôi..........................................................................................................27

2.2.3. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng kỹ

thuật gen.........................................................................................................30

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................37

3.1. Đánh giá tập đoàn các giống lily nghiên cứu.............................................37

3.1.1. Đánh giá quan hệ di truyền các giống lily nghiên cứu bằng chỉ thị

phân tử............................................................................................................37

3.1.2. Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của một số giống lily nghiên cứu ......39

3.1.3. Ngưỡng chịu nóng in vitro của một số giống lily nghiên cứu .......................41

3.2. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi................44

3.2.1. Kiểm tra chất lượng hạt phấn của một số giống hoa lily nghiên cứu ............44

3.2.2. Lai tạo và cứu phôi.........................................................................................45

3.2.3. Bước đầu xác định con lai bằng chỉ thị phân tử.............................................48

3.4.4. Khả năng chịu nhiệt cao của mô vảy củ của các dòng lily lai được

tạo ra...............................................................................................................53

3.3. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng công nghệ gen.......................55

3.3.1. Thiết kế vector chuyển gen chứa gen codA mã hóa choline oxydase............55

3.3.2. Tối ưu hóa qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily bằng

A. tumefaciens.................................................................................................62

vii

3.3.3. Chuyển gen codA mã hóa choline oxydase vào lily.......................................71

3.3.4. Khả năng chịu nóng các dòng lily chuyển gen ..............................................73

3.3.5. Khả năng tích lũy glycine betaine ở một số dòng lily chuyển gen codA.......77

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................79

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................................91

1. Kết luận................................................................................................................91

2. Đề nghị ..................................................................................................................92

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ.................93

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................95

SUMMARY ...........................................................................................................112

PHỤ LỤC...............................................................................................................115

viii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

Bảng 2.1. Danh sách tên và ký hiệu giống lily (Lilium spp.) sử dụng.................21

Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen TP-codA-cmyc và codA-cmyc........23

Bảng 2.3. Tên và trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu..................23

Bảng 2.4. Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu....................23

Bảng 2.5. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn.............................................................24

Bảng 2.6. Môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây lily chuyển gen ........................24

Bảng 3.1. Hệ số tương đồng di truyền giữa 13 giống lily nghiên cứu ................37

Bảng 3.2. Sự phát sinh hình thái và cảm ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ các

giống lily sau 4 tuần nuôi cấy..............................................................40

Bảng 3.3. Tỷ lệ hữu dục và tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn các giống lily

nghiên cứu ...........................................................................................44

Bảng 3.4. Tỷ lệ tạo quả sau thụ phấn của các tổ hợp lai .....................................46

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA tới tỷ lệ nảy mầm và tạo củ in vitro từ hạt

lai được tách ra từ lát cắt quả non .......................................................47

Bảng 3.6. Khả năng sống sót và khả năng tái sinh củ của lát cắt vảy củ 3

dòng lily lai và các dòng bố mẹ sau xử lý nhiệt (37oC ± 1oC, 13

ngày)....................................................................................................54

Bảng 3.7. Tên và trình tự đoạn mồi nhân đoạn promoter HSP18.2 của

A. thaliana.............................................................................................57

Bảng 3.8. Kết quả chuyển gen codA vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens ...............60

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến sự tái sinh củ của lát cắt vảy

củ đã biến nạp......................................................................................64

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hygromycine đến khả năng sống của củ lily

in vitro .................................................................................................65

Bảng 3.11. Khả năng chuyển gen của các chủng A. tumefaciens vào lát cắt

vảy củ lily ............................................................................................66

ix

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen

vào lát cắt vảy củ lily...........................................................................67

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển

gen vào lily ..........................................................................................67

Bảng 3.14. Khả năng nhận các cấu trúc gen ở 3 giống lily nghiên cứu ................71

Bảng 3.15. Khả năng sống sót của các dòng lily chuyển gen in vitro sau xử

lý nhiệt (37 oC ± 1

oC, 13 ngày) ..........................................................74

Bảng 3.16. Khả năng sống sót của mô vảy củ in vitro của 8 dòng lily

chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày)............................75

Bảng 3.17. Khả năng sống sót tạo củ in vitro của lát cắt vảy củ của một số

dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày).............76

Bảng 3.18. Mối quan hệ sự tích lũy glycine betain trong lá và một số đặc

điểm khác của một số dòng lily in vitro..............................................77

x

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR 13 giống lily với mồi ISSR 8 (A),

mồi ISSR 52 (B)..................................................................................37

Hình 3.2. Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 13 giống lily .......38

Hình 3.3. Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC ± 1oC......42

Hình 3.4. Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 42oC ± oC .......43

Hình 3.5. Sự tạo củ lily in vitro từ lát cắt vảy củ(A) và khả năng sống của

củ lily in vitro trong điều kiện nhiệt độ cao(B)...................................44

Hình 3.6. Hạt phấn bắt màu thuốc nhuộm (A) và hạt phấn nảy mầm (B) ..........45

Hình 3.7. Sự cứu phôi bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt bầu nhụy (A);

nuôi cấy phôi (B).................................................................................47

Hình 3.8. Sản phẩm PCR với mồi RAPD của các cặp bố mẹ và dòng con

lai.........................................................................................................49

Hình 3.9. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 51(A) và ISSR 55(B) của tổ hợp

Sor, Bel và 134 ....................................................................................50

Hình 3.10. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 7 (a) và ISSR 55 (b) của tổ hợp Sor

và L; L và F và các con lai....................................................................51

Hình 3.11. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa con lai và dòng bố mẹ .........53

Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm pBI121/35S-TP-codA-cmyc, pBI121/35S￾codA-cmyc và pCAMBIA1301 sau khi cắt bởi enzym giới hạn

HindIII, EcoRI (A) và sản phẩm tinh sạch các đoạn gen (B) ...............55

Hình 3.13. Sơ đồ vùng T- DNA của pCAMBIA1301 tái tổ hợp chứa gen

codA được điều khiển bởi promoter 35S CAMV ...............................56

Hình 3.14. Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của các khuẩn lạc A.

tumefaciens..........................................................................................57

Hình 3.15. Kết quả nhân đoạn (A) và tinh sạch (B) promoter HSP18.2...............58

xi

Hình 3.16. Sản phẩm cắt vector pCAMBIA1301/35S-TP-codA-cmyc/35S￾GUS-Nos, promoter HSP18.2 bằng enzyme giới hạn HindIII,

XbaI (A) và sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu(B).............59

Hình 3.17. Sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen codA trong cây thuốc lá........61

Hình 3.18. Chồi thuốc lá in vitro chuyển gen codA-cmyc (A ) và TP￾codAcmyc (B) khi được xử lý X-gluc..................................................61

Hình 3.19. Hình ảnh điện di protein ở các dòng thuốc lá chuyển gen codA.........61

Hình 3.20. Cây thuốc lá trước (A) và sau (B) xử lý nhiệt (37oC ± 1

oC, 21 ngày) .........62

Hình 3.21. Sự tái sinh củ in vitro từ lát cắt vảy củ lily đã biến nạp sau 4

tuần nuôi cấy .......................................................................................64

Hình 3.22. Củ lily in vitro trong môi trường có hygromycine sau 4 tuần

nuôi cấy ...............................................................................................64

Hình 3.23. Sự biểu hiện tạm thời gen GUS của lát cắt vảy củ sau biến nạp........69

Hình 3.24. Sự biểu hiện gen GUS ở cây lily in vitro 8- 12 tuần tuổi....................69

Hình 3.25. Các bước chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào lát cắt vảy

củ lily in vitro ......................................................................................69

Hình 3.26. Quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua vi khuẩn

A. tumefaciens hiệu quả cao ................................................................70

Hình 3.27. Sự hình thành và phát triển củ lily in vitro của vảy củ được

biến nạp tổ hợp gen đích (gồm gen kháng hygromycin, gen

GUS và gen codA)...............................................................................72

Hình 3.28. Cây lily in vitro được chuyển tổ hợp gen đích (gồm gen kháng

hygromycine, gen GUS và gen codA) bắt màu với thuốc nhuộm

X-gluc..................................................................................................72

Hình 3.29. Ảnh điện di sản phẩm RT – PCR mẫu lily với mồi đặc hiệu gen

codA (A) và gen TP-codA (B)..............................................................73

1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu

thưởng thức hoa và cây cảnh của con người ngày càng được chú trọng.

Lily (tên khoa học là Lilium, thuộc họ Liliaceae) là một trong những loài hoa

đẹp và có giá trị kinh tế cao. Hoa lily có kiểu dáng sang trọng, màu sắc quyến rũ,

hoa thơm, lâu tàn, dễ thu hoạch, dễ bảo quản, dễ vận chuyển và được ưa chuộng ở

nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, cây lily có phổ trồng hẹp, do có xuất xứ ở

những vùng ôn đới có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao. Bên cạnh đó, hiện nay khí hậu

toàn cầu đang ngày càng biến đổi, nhiệt độ tăng lên ảnh hưởng đến nhiều loại cây

trồng, làm giảm năng suất cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển, thậm chí

khiến cây chết là một thách thức lớn cho ngành trồng hoa này. Nước ta nằm trong

khu vực khí hậu nhiệt đới, nên ở khu vực phía bắc chỉ mới bước đầu trồng thử

nghiệm một số giống lily vụ đông. Hơn nữa, sự thay đổi khí hậu cùng sự nóng lên

toàn cầu làm cho việc trồng cây hoa lily này vốn trước đây đã khó lại càng gặp

nhiều trở ngại. Các cây hoa lily sinh trưởng, phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ cao,

thể hiện ở chất lượng cây kém, đặc biệt là hoa xấu, dẫn tới năng suất cũng như chất

lượng cây hoa thấp. Chính vì vậy, việc cải tiến, tạo cây giống mới có năng suất và

chất lượng cao, đặc biệt là có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt độ

cao là nhiệm vụ cấp bách với các nhà nghiên cứu (Đặng Văn Đông, 2010).

Với nhiều phương pháp hiện đại đang được áp dụng, nhiều giống cây trồng

nói chung, cây hoa nói riêng hiện nay đang được phát triển một cách chủ động.

Trong chọn tạo giống hoa lily, lai xa là một phương pháp truyền thống đang được

kết hợp với một số kỹ thuật hiện đại có thể tạo giống mới đạt được nhiều mục đích

khác nhau thông qua việc tái tổ hợp vật chất di truyền của các dòng bố mẹ (VanTuyl

et al., 1991,2003; Chi, 2002). Bên cạnh đó, giống hoa lily cũng ngày càng được làm

phong phú hơn nhờ tiến hành kỹ thuật chuyển gen. Gen codA mã hóa choline

oxidase, tham gia sinh tổng hợp glycin betaine đã được chuyển thành công vào

nhiều loài cây trồng và được chứng minh là cây chuyển gen ít nhiều có khả năng