Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp Endo-β-1,4-Glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN HỮU QUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI-2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN HỮU QUÂN

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Quyền Đình Thi

Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học

Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI-2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN

Trƣớc hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi

trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ

sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng ý tƣởng

nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện

về hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, CN. Đào Thị Tuyết và

tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học

đã tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên

môn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi học tập và rèn luyện

trong suốt quá trình thực tập.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trƣờng

ĐHSP - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho tôi

trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

Bên cạnh đó, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ngƣời

thân đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập để tôi có đƣợc kết

quả nhƣ ngày hôm nay.

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự

giúp đỡ quí báu đó !

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009

Học Viên

Nguyễn Hữu Quân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................... 2

1.1. ĐỊNH NGHĨA......................................................................................... 2

1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2

1.2.1. Nguồn gốc............................................................................................ 2

1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3

1.3. CẤU TRÚC............................................................................................. 5

1.3.1. Cấu trúc bậc nhất.................................................................................. 5

1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6

1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8

1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10

1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11

1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy...................................... 11

1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm.............................................. 12

1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi................................... 13

1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14

1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14

1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16

1.7.1. Nguồn carbon..................................................................................... 16

1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17

1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18

1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng........................................................... 18

1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19

1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19

1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại......................................................... 20

1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22

2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22

2.1.1. Chủng giống....................................................................................... 22

2.1.2. Thiết bị............................................................................................... 22

2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22

2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23

2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24

2.2. PHƢƠNG PHÁP................................................................................... 25

2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25

2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25

2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25

2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh

tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27

2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29

2.2.6. Điện di SDS-PAGE............................................................................ 30

2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase........................... 30

2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử..................................................... 32

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36

3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-

glucanase cao ............................................................................................... 36

3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S

rRNA............................................................................................................ 37

3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39

3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39

3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng........................................... 40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon............................................................. 41

3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon.......................................................... 43

3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44

3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45

3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46

3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy............................................................... 47

3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48

3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase............................................ 50

3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu.................................................................... 50

3.5.2. pH phản ứng tối ƣu............................................................................. 51

3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52

3.5.4. Độ bền pH.......................................................................................... 54

3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55

3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56

3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................... 59

KẾT LUẬN.................................................................................................. 59

KIẾN NGHỊ................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61

TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61

TIẾNG ANH................................................................................................ 64

PHỤ LỤC .................................................................................................... 69

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22

Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23

Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23

Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42

Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A.

oryzae VTCC-F-045..................................................................................... 49

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của

chủng A. oryzae VTCC-F-045...................................................................... 57

Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69

Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae

VTCC-F-045 ................................................................................................ 69

Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70

Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70

Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71

Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71

Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72

Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72

Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73

Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73

Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74

Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75

Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76

Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77

Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77

Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B) của

Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7

Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea.. 8

Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của

cellulase ......................................................................................................... 9

Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase .............. 10

Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11

Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 26

Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae

VTCC-F-045 ................................................................................................ 29

Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae........ 36

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A);

Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI

(C)................................................................................................................ 38

Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39

Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A.

oryzae VTCC-F-045..................................................................................... 40

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41

Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo￾β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045...................................... 44

Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45

Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp

endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045............................. 46