TUYỂN CHỌN, NUÔI cấy CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG hợp ENDO β 1,4 GLUCANASE và xác ĐỊNH TÍNH

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

HÀ NỘI-2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái t nu. e du. v n

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH

TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học

Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI-2009

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................... 2

1.1. ĐỊNH NGHĨA ......................................................................................... 2

1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI............................................................. 2

1.2.1. Nguồn gốc ............................................................................................ 2

1.2.2. Phân loại enzyme ................................................................................. 3

1.3. CẤU TRÚC............................................................................................. 5

1.3.1. Cấu trúc bậc nhất.................................................................................. 5

1.3.2. Cấu trúc không gian ............................................................................. 6

1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC ................................................................................ 8

1.5. Khái quát về Aspergillus oryzae ............................................................ 10

1.6. Ứng dụng .............................................................................................. 11

1.6.1. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy...................................... 11

1.6.2. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm .............................................. 12

1.6.3. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ................................... 13

1.6.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ .................................... 14

1.6.5. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh .............. 14

1.7. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ......................................... 16

1.7.1. Nguồn carbon ..................................................................................... 16

1.7.2. Nguồn nitrogen .................................................................................. 17

1.7.3. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 18

1.7.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng ........................................................... 18

1.8. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME ............................................... 19

1.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ..................................................................... 19

1.8.2. Ảnh hƣởng của pH ............................................................................. 20

1.8.3. Ảnh hƣởng của các ion kim loại ......................................................... 20

1.8.4. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa ......................... 21

Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................... 22

2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ........................................................ 22

2.1.1. Chủng giống ....................................................................................... 22

2.1.2. Thiết bị............................................................................................... 22

2.1.3. Hóa chất ............................................................................................. 22

2.1.4. Dung dịch và đệm phá tế bào ............................................................. 23

2.1.5. Môi trƣờng ......................................................................................... 24

2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................... 25

2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme ......................................................... 25

2.2.2. Định tính endo-β-1,4-glucanase.......................................................... 25

2.2.3. Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase............................................ 25

2.2.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên khả năng sinh

tổng hợp endo-β-1,4-glucanase .................................................................... 27

2.2.5. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................ 29

2.2.6. Điện di SDS-PAGE ............................................................................ 30

2.2.7. Xác định tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ........................... 30

2.2.8. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ..................................................... 32

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 36

3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-

glucanase cao ............................................................................................... 36

3.2. Phân loại chủng nấm sợi A. oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S

rRNA............................................................................................................ 37

3.3. Tối ƣu các điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ..................... 39

3.3.1. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ........................... 39

3.3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng........................................... 40

3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon............................................................. 41

3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon .......................................................... 43

3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen .......................................................... 44

3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen ....................................................... 45

3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy ............................................................................... 46

3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy ............................................................... 47

3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase ................................................... 48

3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase ............................................ 50

3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu .................................................................... 50

3.5.2. pH phản ứng tối ƣu............................................................................. 51

3.5.3. Độ bền nhiệt ....................................................................................... 52

3.5.4. Độ bền pH .......................................................................................... 54

3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ....................................................... 55

3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa .................................................... 56

3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại ............................................................... 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 59

KẾT LUẬN.................................................................................................. 59

KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 61

TIẾNG VIỆT ............................................................................................... 61

TIẾNG ANH ................................................................................................ 64

PHỤ LỤC .................................................................................................... 69

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thiết bị đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 22

Bảng 2.2. Các hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ............................... 23

Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 23

Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của 35 chủng A. oryzae .............. 37

Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 42

Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A.

oryzae VTCC-F-045..................................................................................... 49

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của

chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 57

Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose................................................................... 69

Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae

VTCC-F-045 ................................................................................................ 69

Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian ..................... 70

Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 70

Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71

Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 71

Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72

Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 72

Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 72

Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73

Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 73

Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-

glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 74

Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase...................................... 75

Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase......................................... 76

Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 77

Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 77

Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-

glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 78

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc không gian từ trên xuống (A) và từ bên sang (B)

của

Cel12A từ H. grisea ....................................................................................... 7

Hình 1.2. Cấu trúc vùng liên kết enzyme - cơ chất của Cel12A từ H. grisea..

8

Hình 1.3. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B)

của

cellulase ......................................................................................................... 9

Hình 1.4. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase ..............

10

Hình 1.5. Cấu trúc bộ gene của A. oryzae .................................................... 11

Hình 2.1. Đƣờng chuẩn glucose ................................................................... 26

Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae

VTCC-F-045 ................................................................................................ 29

Hình 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng A. oryzae........ 36

Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng A. oryzae (A);

Sản phẩm Plasmid (B) và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và

XbaI (C).

............................................................................................................... 38

Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................... 39

Hình 3.4. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian của chủng A.

oryzae VTCC-F-045..................................................................................... 40

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 41

Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo￾β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 44

Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-

1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 45

Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng

hợp

endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................. 46

Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme

endo￾β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................... 47

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β￾1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ......................................... 48

Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE

của chủng A. oryzae VTCC-F-045

(B)................................................................ 49

Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-

glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................... 51

Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở

chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 52

Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của

chủng A. oryzae VTCC-F-045 ...................................................................... 53

Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A.

oryzae VTCC-F-045..................................................................................... 54

Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-

glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045 ............................................................... 55

Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase

của chủng A. oryzae VTCC-F-045

...................................................................... 56

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

µg

Microgram

µl

Microliter

APS Ammonium persulphate

Cel Cellulose

CMC Carboxyl methyl cellulase

cs Cộng sự

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

kb Kilobase

kDa Kilo Dalton

M Marker (thang protein chuẩn)

MTK Môi trƣờng khoáng

MW Molecular Weight

OD Optical density

PCR Polymerase chain reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane

U Unit

v/v Volume/volume

w/v Weight/volume

MỞ ĐẦU

Endo-β-1,4-glucanase là một trong ba dạng của cellulase. Chúng thuộc

nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie một

cách ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và

một số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân

giải mạnh mẽ cellulose vô định hình.

Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau

nhƣ động vật (thuộc các nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm của các

hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật. Tuy

nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu vẫn từ vi sinh vật. Vi sinh vật sinh enzyme

hết sức đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus,

Trichoderma viride) và vi khuẩn (thuộc họ Bacillus).

Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác

nhau nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy; công nghiệp chế biến thực

phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến

dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi

sinh.

Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi

sinh vật tổng hợp enzyme rất đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng các phế phụ

phẩm trong nông nghiệp, chúng tôi đã chọn đề tài:

Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp

endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A. oryzae sinh tổng hợp endo-β￾1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase

ngoại bào từ chủng A. oryzae và xác định tính chất hóa lý của endo-β-1,4-

glucanase.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái 1 t nu. e du. v n