Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ruột gà nuôi tự nhiên ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn nuôi gà công nghiệp :Luận văn thạc sĩ - Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

1-i

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGÔ CHÍ CÔNG

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ ĐẶC

TÍNH PROBIOTICS TỪ RUỘT GÀ NUÔI TỰ

NHIÊN ỨNG DỤNG TẠO CHẾ PHẨM BỔ SUNG

THỨC ĂN GÀ NUÔI CÔNG NGHIỆP

Chuyên Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã Chuyên Ngành: 60540101

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019

1-ii

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh.

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Ngọc Nam

Người phản biện 1: ...................................................................................................

Người phản biện 2: ...................................................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn thạc sĩ Trường Đại

học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày . . . . . tháng . . . . năm . . . . .

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

1. ......................................................................- Chủ tịch Hội đồng

2. ......................................................................- Phản biện 1

3. ......................................................................- Phản biện 2

4. ......................................................................- Ủy viên

5. ......................................................................- Thư ký

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA…………

1-iii

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGÔ CHÍ CÔNG………………… MSHV: 16002161

Ngày, tháng, năm sinh: 20/08/1992..............................Nơisinh: Bình Định................

Chuyên ngành: Công Nghệ Thực Phẩm.......................Mã chuyên ngành: 60540101 .

I. TÊN ĐỀ TÀI:

Tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ruột gà nuôi tự nhiên ứng dụng

tạo chế phẩm bổ sung thức ăn gà nuôi công nghiệp

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics từ ruột gà nuôi tự

nhiên và ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung thức ăn chăn nuôi gà công nghiệp.

II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Theo quyết định số 592/QĐ-ĐHCN về việc giao đề

tài và cử người hướng dẫn luận văn thạc sĩ của Hiệu trưởng trường Đại học Công

Nghiệp TP. HCM ngày 01 tháng 02 năm 2018

III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/08/2018

IV. NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Trịnh Ngọc Nam

Tp. Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2019

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

VIỆN TRƯỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

i

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và nghiên cứu, với sự giúp đỡ tận tình của Thầy Cô, gia đình

và bằng sự nỗ lực của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn nghiên cứu. Để đạt được

kết quả này, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến:

Thầy Trịnh Ngọc Nam đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm

vô cùng quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn tốt

nghiệp. Mặc dù, Thầy rất bận rộn với công việc giảng dạy nhưng vẫn luôn theo dõi,

hướng dẫn và chỉ bảo giúp tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm trong luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô của Viện công nghệ sinh học và thực phẩm,

Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh đã cho tôi những kiến thức

quý báu trong thời gian học tập tại trường. Những kiến thức được tích lũy từ sự giảng

dạy tận tình của quý Thầy Cô đã giúp tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Cổ phần Kỹ Thuật Sao Mai đã tạo

mọi điều kiện tốt nhất để tôi được hoàn thành tốt các thí nghiệm tại Phòng nghiên

cứu và phát triển sản phẩm của công ty.

Cuối lời tôi xin kính chúc quý Thầy Cô và Ban lãnh đạo công ty dồi dào sức khỏe và

thành công trong cuộc sống!

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Probiotic được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm,

chăn nuôi. Sử dụng probiotic một cách hợp lý giúp vật nuôi khỏe mạnh, tăng sức đề

kháng, cạnh tranh với các vi sinh vật gây bệnh, giúp chuyển đổi hệ số tiêu hóa thức

ăn tốt hơn và giảm dần lượng thuốc, kháng sinh sử dụng, đặc biệt đối với ngành chăn

nuôi công nghiệp. Nguồn vi sinh vật có đặc tính probiotic từ trong tự nhiên rất đa

dạng và phong phú đặc biệt là trong đường ruột của vật nuôi. Mục tiêu nghiên cứu

của đề tài là phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic từ ruột gà

nuôi tự nhiên để ứng dụng tạo chế phẩm probiotic bổ sung thức ăn chăn nuôi gà công

nghiệp. Từ 50 chủng vi khuẩn phân lập được từ ruột gà, tiến hành khảo sát khả năng

chịu pH acid, khả năng chịu muối mật, khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm

nghiệm, khả năng thích nghi với một số loại kháng sinh thông dụng trong chăn nuôi,

khảo sát khả năng hình thành bào tử ở 60oC, và khả năng bám dính vào niêm mạc

đường ruột. Kết quả đã tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn C19, C31 và C43 có đặc

tính probiotic tốt: khả năng chịu pH 1.5 trong 3 giờ, chịu được nồng độ muối mật

1.5% trong 10 giờ, khả năng kháng lại các vi sinh vật kiểm nghiệm như Escherichia

coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus với đường kính vô khuẩn từ 9 – 14 mm,

khả năng hình thành bào tử ở 60oC là ≥ 80% hay khả năng chịu được với enzyme

pepsin, pancreatin trong 180 phút. Tiến hành định danh các chủng vi khuẩn đã tuyển

chọn dựa vào vùng gen 16S rRNA đã xác định là các chủng Bacillus cereus, Bacillus

megaterium, Bacillus sp.. Chế phẩm probiotic trên của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

trên nền chất mang mantose dextrin và bột whey protein có mật độ 108 CFU/g cho

thấy hiệu quả trong sự sinh trưởng của gà nuôi công nghiệp. Những kết quả của

nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng của vi khuẩn probiotic phân lập từ đường

ruột vật nuôi trong chăn nuôi.

Từ khóa: probiotic, chế phẩm sinh học, Bacillus, gà nuôi công nghiệp, bào tử

probiotic

iii

ABSTRACT

Nowadays, probiotics are widely used in food products, pharmaceutical and

considered as one of the main components of livestock industry. These

microorganisms have strong influence on animal health by improving food digestion,

increasing immune system and acting against many pathogentic microorganisms.

Microbial sources with probiotic properties are abundant in nature, especially in

livests gastrointestinal tract. The aims of this study are evaluating the probiotic

potential of 50 bacterium strains isolated from chichken intestine to produce probiotic

preparation for use in the poultry industry. Parameters consisted of the ability to

acidic, heat and bile salt tolerance, produce spores, pathogen antagonistic activity,

and ability to adhere to intestine. Three strains, C19, C31 and C43, were selected with

good probiotic characteristics such as tolerance to low pH 1.5 after 3 hrs culture,

tolerance to 1.5% bile salt after 10 hrs, resistance to gastrointestinal pathogens

Salmonella sp., Escherichia coli, and Staphylococcus aureus with zone of inhibition

diameter 9-14mm, resistance to gentamicin, amoxicillin, ampicillin, vancomicin,

doxycicline antibiotics, and good adhesion ability on chicken intestinal epithelium.

Moreover, heat tolerance at 60oC for these strains were identified. Using gene

sequencing of 16S rRNA, C19, C31 and C43 were identified as strains Bacillus

cereus, Bacillus megaterium, and Bacillus sp. The probiotic products of the selected

strains contain 108 CFU/g showed effective in the growth of industrial chicken. Taken

together, the results of this study showed the applicability of probiotic bacteria

isolated from chicken gastrointestine for the poultry industry.

Keywords: probiotic, probiotics, Bacillus, the poultry industry, probiotic spores

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các kết quả nghiên

cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất kỳ một nguồn

nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được

thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định.

Học viên

Ngô Chí Công

v

MỤC LỤC

MỤC LỤC………………………………………………...…………………………v

DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU ....................................................................................ix

MỞ ĐẦU ………………………………………………………………………....1

1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................2

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...............................................................3

4. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu..................................................3

5. Ý nghĩa của đề tài.......................................................................................4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................5

Probiotic.....................................................................................................5

Định nghĩa ‘’Probiotic’’..........................................................................5

Đặc điểm chung của các chủng vi sinh vật probiotic ...............................5

Vai trò và cơ chế tác dụng của các chủng vi sinh vật probiotic đối với vật

chủ ……………………………………………………………………………8

Vai trò của các chủng probiotic đối với vật chủ ................................8

Cơ chế tác dụng của các vi sinh vật probiotic đối với vật chủ ...........9

Tình hình nguyên cứu và ứng dụng của probiotic trên thế giới và Việt

Nam …………………………………………………………………………..11

Thế giới..........................................................................................11

Việt Nam........................................................................................12

Một số chủng vi sinh vật probiotic phổ biến..........................................13

Lactobacillus sp..............................................................................13

Bifidobacterium sp..........................................................................15

Bacillus sp......................................................................................16

Đặc điểm của gà....................................................................................19

Đặc điểm sinh trưởng của gà ..........................................................19

Đặc điểm hệ tiêu hóa của gà ...........................................................20

Đặc điểm hệ vi sinh vật đường ruột ở gà.........................................22

Tổng quan về chế phẩm probiotic..........................................................23

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................25

Vật liệu.....................................................................................................25

vi

Đối tượng..............................................................................................25

Thiết bị, dụng cụ.............................................................................25

Hóa chất, môi trường......................................................................26

Phương pháp nguyên cứu .........................................................................27

Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu..........................................28

Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật Probiotic....................28

Quan sát hình thái khuẩn lạc đặc trưng và hình thái hiển vi của các

chủng vi sinh vật………………….........………………………………………….28

Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic..................29

Bảo quản và lưu trữ các chủng vi sinh vật probiotic........................29

Khảo sát khả năng chịu được pH của dạ dày...................................30

Khảo sát khả năng dung nạp muối mật ...........................................30

Phương pháp xác định khả năng kháng khuẩn và sinh bacteriocin ..31

Khảo sát khả năng chịu được một số loại kháng sinh thông dụng

trong chăn nuôi......................................................................................................32

Khả năng chịu được enzyme trong dạ dày và đường ruột................33

Khảo sát khả năng hình thành bào tử của các chủng vi khuẩn

probiotic ……………………………………………………………………...33

Xác định khả năng bám dính vào niêm mạc đường ruột..................34

Định danh các chủng vi khuẩn probiotic bằng phương pháp giải trình

tự vùng gen 16S rRNA ...………………………………………………………….35

Phương pháp phối trộn tạo chế phẩm probiotic .....................................36

Phương pháp kiểm nghiệm và đánh giá hiệu quả chế phẩm probiotic trên

gà …………………………………………………………………………..36

Khả năng tăng trọng .......................................................................38

Ngoại hình......................................................................................38

Đánh giá mức độ nhiễm các loại bệnh thông thường ở gà ...............38

Tỉ lệ các chủng vi sinh vật gây hại trong phân gà............................38

Phương pháp xử lý số liệu.....................................................................38

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................39

Phân lập các chủng vi sinh vật..................................................................39

Kết quả khảo sát khả năng chịu được acid của dạ dày...............................47

Kết quả khảo sát khả năng chịu được muối mật........................................55

Kết quả khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm nghiệm và khả

năng sinh bacteriocin.............................................................................................60

vii

Kết quả khảo sát khả năng chịu được một số loại kháng sinh thông dụng

trong chăn nuôi......................................................................................................63

Kết quả khảo sát khả năng hình thành bào tử của các chủng probiotic ......67

Kết quả định danh các chủng vi khuẩn probiotic.......................................69

Kết quả khảo sát khả bám dính vào niêm mạc ruột của các chủng vi khuẩn

probiotic ................................................................................................................77

Kết quả khảo sát khả năng chịu được enzyme của dạ dày và ruột .............78

Kết quả phối trộn tạo chế phẩm probiotic từ các chủng vi khuẩn probiotic

phân lập được ........................................................................................................81

Kết quả kiểm nghiệm và đánh giá hiệu quả chế phẩm probiotic trên gà ....82

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................88

1. Kết luận....................................................................................................88

2. Kiến nghị..................................................................................................89

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….90

PHỤ LỤC ……………………………………………………………………......95

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN.....................................................107

viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu tạo của một dạng bào tử vi khuẩn Bacillus.......................................17

Hình 1.2 Các giai đoạn nảy mầm của một bào tử Bacillus .....................................19

Hình 1.3 Sơ đồ hệ tiêu hoá của gà..........................................................................20

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực hiện ……………………………...………27

Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hưởng của pH đối với sự phát triển các chủng vi khuẩn trong

thời gian 3 giờ ………………………...……………55

Hình 3.2 Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ muối mật đối với sự phát triển các chủng

vi khuẩn trong thời gian 10 giờ 60

Hình 3.3 Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh 63

Hình 3.4 Kết quả khảo sát khả năng chịu được kháng sinh 66

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm hình thành bào tử của các giống vi khuẩn

ở các mức nhiệt độ khác nhau 69

Hình 3.6 Kết quả điện di các chủng vi khuẩn 69

Hình 3.7 Cây phát sinh loài chủng C19 73

Hình 3.8 Cây phát sinh loài của chủng C31 74

Hình 3.9 Cây phát sinh loài chủng C43 75

Hình 3.10 Cây phát sinh loài của chủng C47 76

Hình 3.11 Chế phẩm probiotic từ chủng vi khuẩn C43 82

Hình 3.12 Gà nuôi thí nghiệm với chế phẩm probiotic C43 ở giai đoạn 40 ngày tuổi

83

Hình 3. 13 Biểu đồ thể hiện tốc độ tăng trọng trung bình của gà qua các lô thí

nghiệm 85