Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhuộm tế bào phục vụ chẩn đoán bệnh

1

Tổng hợp cơ chất, chế tạo kít và

nghiên cứu điều kiện tối ưu để

nhuộm tế bào phục vụ chẩn

đoán bệnh ung thư bạch cầu

Trần Văn Tính

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận án TS ngành: Hóa học hữu cơ; Mã số: 62 44 27 01

Người hướng dẫn: PGS.TSKH. Lưu Văn Bôi, GS.TS.

Nguyễn Anh Trí

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N￾thế)naphtalen-2-cacboxamit làm nguyên liệu điều

chế cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu

người. Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế￾cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất

nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người. Xác định

cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng các

phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H￾NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa

độ nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc

phân tử cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng

tử. Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế￾cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat để nhuộm

esteraza đặc hiệu bạch cầu người và tìm kiếm cơ

chất mới có độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Nghiên cứu

2

ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế X, hiệu

ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm

amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ chất

đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm

esteraza. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm

bằng phương pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo

bộ kít nhuộm esteraza dùng phân loại dòng tế bào

trong bệnh bạch cầu người từ cơ chất tổng hợp được.

Keywords: Hóa hữu cơ; Tổng hợp cơ chất; Chế tạo

kit; Nhuộm tế bào; Ung thư bạch cầu

Content

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay việc phân loại dòng tế bào ung thư máu theo

tiêu chuẩn của các nhà khoa học Pháp, Mỹ và Anh (gọi tắt

là tiêu chuẩn FAB) chủ yếu dựa trên kết quả của ba phương

pháp: đánh dấu, miễn dịch và nhuộm hóa học tế bào.

Nhuộm esteraza đặc hiệu là một trong những phương pháp

phổ biến để phân biệt ung thư bạch cầu dòng tuỷ với các

dòng tế bào khác trong bệnh máu ác tính. Naphtol AS-D

cloaxetat là một cơ chất được sử dụng rộng rãi để nhuộm

esteraza đặc hiệu do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối với

tế bào bạch cầu dòng tuỷ so với các cơ chất khác. Ngoài ra

naphtol AS-D cloaxetat còn dùng để phân biệt nhiều loại

đối tượng khác như vi khuẩn từ sa khoáng biển, khuẩn cầu

tách từ huyết thanh nhiễm HIV… Tuy nhiên, có nhiều khó

khăn khi sử dụng naphtol AS-D cloaxetat để nhuộm tế bào.

Một là, cho đến nay việc tổng hợp nguyên liệu đầu vẫn

thực hiện theo phương pháp truyền thống nên hiệu suất

3

thấp; thứ hai, kết quả nhuộm chênh lệch so với phương

pháp di truyền và miễn dịch còn cao (~29%); thứ ba, là cơ

chất dễ phân hủy khi nhiệt độ >-200C, khó khăn trong vận

chuyển và bảo quản. Vì vậy, nghiên cứu sử dụng phương

pháp tiên tiến để tổng hợp cơ chất mới có hoạt tính cao và

giá thành rẻ hơn nhằm sản xuất kít nhuộm esteraza tế bào

bạch cầu ở Việt Nam, phục vụ việc khám và chữa bệnh cho

cộng đồng là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn và kinh

tế - xã hội cấp thiết.

2. Mục đích nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là ứng dụng phương

pháp mới, hiệu quả cao để tổng hợp cơ chất; khảo sát một

cách có hệ thống mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính để

tìm kiếm cơ chất mới có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn;

tối ưu hóa các điều kiện nhuộm nhằm giảm sự chênh lệch

và chế tạo bộ kít nhuộm esteraza để phân loại tế bào phục

vụ việc khám và điều trị bệnh ung thư máu.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án

1- Nghiên cứu tổng hợp các 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit làm nguyên liệu điều chế cơ chất nhuộm

esteraza đặc hiệu tế bào bạch cầu người.

2- Nghiên cứu tổng hợp các este 3-(N-thế￾cacbamoyl)naphtalen-2-yl cacboxylat làm cơ chất

nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người.

3- Xác định cấu trúc của các hợp chất điều chế được bằng

các phương pháp vật lý và hóa lý hiện đại (Phổ IR, 1H￾NMR và MS) và nghiên cứu mối tương quan giữa độ

nhạy của phản ứng nhuộm esteraza với cấu trúc phân tử

cơ chất bằng phương pháp tính hóa lượng tử.

4

4- Nghiên cứu sử dụng este 3-(N-thế-cacbamoyl)naphtalen￾2-yl cacboxylat để nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu

người và tìm kiếm cơ chất mới có độ đặc hiệu và độ

nhạy cao.

5- Nghiên cứu ảnh hưởng hiệu ứng electron các nhóm thế

X, hiệu ứng không gian của các gốc N-hiđrocacbon

nhóm amit thế và các gốc cacboxylat trong phân tử cơ

chất đến độ nhạy và độ đặc hiệu đối với phản ứng nhuộm

esteraza.

6- Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình nhuộm bằng phương

pháp đơn hình và ứng dụng để chế tạo bộ kít nhuộm

esteraza dùng phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu

người từ cơ chất tổng hợp được.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

- Đã nghiên cứu tìm được điều kiện thích hợp để điều chế

các nguyên liệu đầu 3-hiđroxi-(N-thế)naphtalen-2-

cacboxamit bằng phương pháp truyền thống và phương

pháp sử dụng kỹ thuật vi sóng.

- Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa 3-hiđroxi-

(N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với các caboxylic

cloanhiđrit và đã tổng hợp được các hợp chất 3-(N-thế￾cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat có hoạt tính với

esteraza đặc hiệu bạch cầu người.

- Đã nghiên cứu một cách có hệ thống và xác định được ảnh

hưởng của hiệu ứng electron các nhóm thế X, yếu tố không

gian của các gốc N-hiđrocacbon nhóm amit thế và của các

gốc cacboxylat lên hoạt tính nhuộm esteraza đặc hiệu bạch

cầu người.

- Đã khảo sát có hệ thống phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu

bạch cầu người bằng các hợp chất 3-(N-thế)naphtalen-2-yl￾cacboxylat và đã xác định được cơ chất mới có độ nhạy

cao hơn cơ chất naphtol AS-D cloaxetat của hãng Sigma

5

bán trên thị trường.

- Đã tiến hành nghiên cứu kế hoạch hóa thực nghiệm theo

phương pháp đơn hình và tìm được điều kiện tối ưu sản

xuất kít nhuộm esteraza để phân loại dòng tế bào bệnh

bạch cầu cấp.

5. Điểm mới của luận án

- Đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật mới hiệu quả cao là

phương pháp lò vi sóng để tổng hợp 16 3-hiđroxi-(N￾thế)naphtalen-2-cacboxamit, trong đó có 3 chất mới.

- Đã nghiên cứu cải tiến quy trình phản ứng giữa các 3-

hiđroxi- (N-thế)naphtalen-2-cacboxamit với cacboxylic

cloanhiđrit. Kết quả đã tổng hợp được 38 dẫn xuất 3-(N￾thế-cacbamoyl)naphtalen-2-yl-cacboxylat, trong đó có 36

chất mới.

- Trên cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng của hiệu ứng electron,

hiệu ứng không gian và các gốc nhị diện của nhóm

cacboxyl lên độ đặc hiệu, độ nhạy của cơ chất đối với

phản ứng nhuộm esteraza, đã xác định được: Các nhóm

thế đẩy cho điểm nhuộm cao hơn các nhóm thế hút điện

tử, các nhóm thế hút điện tử ở vị trí octo- cho điểm nhuộm

cao hơn vị trí para-. Điểm nhuộm cao nhất thuộc về các

gốc N-hiđrocacbon amit thế và các nhóm cacboxylat kích

thước trung bình. Các góc nhị diện của nhóm cacboxyl có

ảnh hưởng quan trọng đối với độ chọn lọc của esteraza

trong phản ứng thủy phân gốc este và độ nhạy của cơ chất.

- Đã điều chế được naphtol AS-OL -clopropionat làm cơ chất

mới có độ đặc hiệu tương đương, nhưng độ nhạy cao hơn