Thực hành hóa sinh học

Đ A I H O C Q U Ố C GI A HA NÔI

NGUYẾN VÀN MÙI

ffia ! (Ị}G Hểl NỌI NHÀ XUẢT Bá n đại học quốc gia h à nội

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

• • •

NGUYỄN VẢN MỪI

THỰC HÀNH ■

HOÁ SINH HỌC

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI - 2001

Lời nói d ầ u ...................................................................................................................................... ~

Chương 1. Hoá c h ấ t và d u n g d ịc h .............................................................................................9

I. Khái niệm vê hoá c h ấ t................................................................................................................ 9

II. Dung dịch................................................................................................................................. 13

III. Nồng độ dung dịch................................................................................................................ 14

IV. Pha dung dịch tiêu chuẩn để chuẩn độ.............................................................................. 22

V. Cách tính hệ số điều ch ỉn h .....................................................................................................25

VI. Bài t ậ p ....................................................................................................................................... 26

Chương 2. P hư ơng pháp lấy m ẩu phản t í c h .....................................................................29

I. Lấy m ẫ u ....................................................................................................................................... 29

II. Chuẩn bị mẫu phán tích..........................................................................................................31

III Cỏ định m ẫ u .............................................................................................................................. 31

Chương 3. P hư ơng pháp so m a u ............................................................................................ 34

I . Phương pháp so m àu.................................................................................................................34

II. Định luật Lambert-Beer......................................................................................................... 35

III. Màu dung dịch và chọn hước sóng ánh sáng (hay chọn kinh lọc m àu)...................... 37

Chương 4. P h ư ơ n g pháp q u a n g ph ố k ế ................................................................................43

I. Hấp thụ tử ngoại của các loại cuvet khác n h a u ................................................................ 44

II. Quang phổ hấp thụ tử ngoại của NAD* và N A D H.......................................................... 44

III. Ước tính khôi lượng NADH...................................................................................................45

C hương 5. Đ inh lượng g lu x it.....................................................................................................46

I. Định lượng đường khứ theo phương pháp B ertrand......................................................... 46

II. Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich..............................50

III. Định lượng glucozd trong máu bằng phương pháp N elson......................................... 52

rv. Định lượng fructozd trong (lung dịch có lản đường khử khác................................................ 53

V. Định lượng đường khử bằng phường pháp axit. dinitro-salicylic (DNS)......................55

VI. Định lượng sacarozd theo phương pháp thuỷ phân bằng axit........................................56

VII. Đinh lượng tinh bột theo phương pháp thuỷ phân bằng a x it.......................................57

VIII. Định lượng xenlulozơ.......................................................................................................... 59

IX. Định lượng pectin bằng phương pháp canxi p ectat....................................................60

X. Định lượng dextrin bằng phương pháp kết tủa vối cồn................................................. 61

Chương 6. Đ ịnh lượng lipĩt.................................................................................................... 63

I. Định lượng lipit bằng máy Soxhlet...................................................................................... 63

II. Xác định các chỉ sô của lipit................................................................................................ 6 6

Chương 7. Định lương axỉt amin và p ro tein ................................................................... 72

I. Định lượng axit amin bằng phương pháp chuẩn độ íbrmol (phương pháp Sorensen)

................................................... .............. ............................*................. ......................................... 72

II. Định lượng axit amin bằng n inhiđnn................................................................................74

III. Định lượng axit amin nhờ tạo thành phức chất vối đồng (Phương pháp Pope và

Stevens).........................................................................................................................................76

IV. Định lượng nitd bằng phương pháp Kjeldahl.................................................................. 78

V. Định lượng protein bằng phương pháp Lowrv.................................................................83

VI. Định lượng protein tỏng sỏ, albumin và globulin trong huyêt thanh máu hằng

phương pháp Biure......................................................................................................................84

VII. Định lượng protein bằng Coomasie Brilliant Blue G-250......................................... 8 6

VIII. Định lượng protein bằng phương pháp quang phô.....................................................89

Chương 8. Đ ịnh lượng axit n u c le ic ......................................................................................92

I. Phương pháp Schimidt và Thannhauser............................................................................ 92

II. Phương pháp Schneider........................................................................................................ 94

III. Phương pháp Ogur và Rosen.............................................................................................95

IV. Phướng pháp quang phố......................................................................................................97

V. Định lượng hợp chất photpho trong mô ruột theo phương pháp Schmidt và

Thannhauser có sửa đổi.............................................................................................................98

VI. Định lượng photpho theo phương pháp Horecker và các cộng sự..............................101

VII. Định lượng photpho vỏ cơ có nguồn gốc từ photpholipit theo phường pháp Delorv

..................... ......... ......................ĩ............................................ .............................101

VIII. Định lượng ARN bằng orxinol........... ........................................................................... 102

IX. Định lượng ADN bằng phướng phấp điphenylamin.................................................. 104

Chương 9. Xáo định hoạt đô của m ột sô e n z im ............................................................106

I. Định nghĩa (lơn vị hoạt độ của enzim...............................................................................106

II. Chú ý khi xác định hoạt độ enzim.................................................................................... 106

III. Xác định hoạt độ của ascorbat oxidaza.......................................................................... 107

IV. Xác định hoạt độ của a- amylaza theo Rukhliadeva Geriacheva........................................108

V. Xác định hoạt độ của catalaza...........................................................................................112

VI. Xác định hoạt độ cholinesteraza của huyết thanh (ChE) - phương pháp sửa đổi của

Hestrin......................................................................................................................................... 113

VII. Xác định hoạt độ của glucoamylaza...............................................................................114

VIII . Xác định hoạt độ lipaza.................................................................................................116

IX. Xác định hoạt độ papain....................................................................................................118

X. Xác định hoạt độ pepsin bằng phương pháp Anson...................................................... 121

4

XI. Xác định hoạt độ peroxidaza............................................................................................ 123

XII. Xác định hoạt độ photphataza kiếm và photphataza axit theo phương pháp King -

Armstrong................................................................................................................................... 125

XII ỉ. Xác định hoạt độ proteinaza theo phương pháp Anson cai tiên.........................................127

XIV. Xác định hoạt độ ureaza theo phương pháp chuân độ...............................................130

Chương 10. Đ ịnh lượng v ita m in ..........................................................................................132

I. Định lượng vitamin c theo phương pháp chuẩn đ ộ ........................................................132

II. Định lượng vitamin B2 bằng phương pháp huỳnh quang........................................... 135

III. Định lượng vitamin B1 bằng phương pháp huỳnh quang............................................ 142

Chương 11. Đ ịnh lượng m ột sô" nguyên t ô ...................................................................... 144

I. Định lượng photpho.............................................................................................................. 144

II. Định lượng Kali tổng sô của thực vật bằng Natri Cobantinitrit............................................ 150

III. Định lượng Canxi và Magie tống sô của thực vật bằng trilon B ............................... 151

IV. Định lượng Canxi trong mô cơ theo phương pháp Retinxki......................................152

V. Định lượng sắt....................................................................................................................... 154

("hương 12, Phụ lục.................................................................................................. 155

I. Các dung dịch đệm ................................................................................................................ 155

II. Dung dịch pH chuẩn............................................................................................................163

III. Nồng độ axit và amoniac thường g ặ p .............................................................................163

IV. Pha dung dịch phần trăm axit và amoniac....................................................................164

V. Khỏi lượng mol phân tử và tỷ khôi của một sô" a x it...................................................... 165

VI. Kiêm tra nồng r* \ các dung dịch chuẩn độ đã pha bằng dung dịch chát gốc có nồng

độ chính xác................................................................................................................................ 165

VII. Chỉ thị màu axit - bazơ.................................................................................................... 166

VIII. Cách pha và sử dụng một số thuốc thử chỉ thị màu thông thường........................ 167

IX. Các dung dịch rửa dụng cụ bẩn trong phòng thí nghiệm......................................... 168

X. Nguyên tử khôi của một sô" nguyên tô"..............................................................................169

XI. Nồng độ dung dịch amoni sunfat băo hoà ở nhiệt độ khác nhau.......................................... 170

XII. Cách tính lực li t â m ..........................................................................................................170

XIII. Các ký hiệu quy định kích thưóc và các phần thập p h ân ........................................170

XIV. Các chữ cái Hy L ạp..........................................................................................................171

XV. Các tính chất của một sô đồng vị phóng xạ ứng dụng trong y sinh học.................171

XVI. Sự phụ thuộc của tỷ khổi và chỉ sô" khúc xạ vào nồng độ dung dịch.......................172

Tài liệu th am k h ả o .................................................................................................................... 173

5

L ờ i n ó i đ ầ u

Giáo trình "Thực hành hoá sinh học” dùng cho sinh viên năm thứ ba, ngành Công

nghệ Sinh học, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quỏc gia

Hà Nội.

Sinh viên tiến hành làm 20 bài thực hành của 11 chương khác nhau, tùy thuộc

điều kiện, cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm cho phép. Cán bộ phụ trách thực hành

có thê lựa chọn các bài của các phần như: cách tính toán các loại nồng dộ, xứ lý mẫu

till nghiệm, phương pháp so màu, phương pháp quang phổ kê, định lượng gluxit, định

lưựng lipit., định lượng axit amin và protein, định lượng axit nucleic, xác định hoạt độ

định lượng vitamin, định lương một sô' nguyên tô'kim loại ...

Ngoài ra, quyên sách còn được dùng cho thực tập chuyên đề của sinh viên năm

t hủ' tư và phục vụ cho học viên cao học làm luận án thạc sĩ thuộc chuyên ngành Hoá

sinh học, trưòng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Sách đả được sửa chửa và bố sung một sô phương pháp ở các chương định lượng

protein, xác* định hoạt độ một sô" enzim, định lượng một sô" nguyên tô" kim loại... so với

lan xuàt ban đầu.

Tác giả

7

C h ư ơ n g 1

HOA CHAT VA DƯNG DỊCH

I. KHÁI NIỆM VỂ HOÁ CHẤT

1 . Các c h ấ t hoả học

Các chất dùng đê phân tích hoá học, làm tiêu bản.... trong phòng thí nghiệm được

gọi là hoá chất. Các hoá chất có thê là chất rắn, lỏng, khí có mức độ tinh khiết khác

nhau.

- Sạch kỹ thuật

- Sạch phản tích

* Sạch hoá học

Hoá chất được-'đóng trong các chai lọ thuỷ tinh, nhựa... có nhãn ghi (Hình 1 .1 ):

- Tên hoá chất

- Công thức hoá học

- Mức độ sạch

- Khôi lượng hoá chất

- Phân tử khôi

- Nơi sán xuất

- Điều kiện bảo quản

Ethyl acetate GPR

CH3COOC2H5 M.W.88.11

g/ml 0.90

99%

By IR spectrum

Maximum Limits o f Impurities

Water

Non-volatile matter

Acidity (CH3COOH)

Ethanol

Heavy metals (as Pb)

0.5%

0.0002%

0.005%

0.05%

0.1%

Hinh 1.1 - Nhãn hoá chất

9

Tính chất nguy hiểm của hoá chất được cảnh báo bằng các ký hiệu in trên n h à n

hoá chất (Hình 1.2).

Chất ản mòn Chất kích thích Chất dễ nổ

Chất dễ cháy Chất dễ oxi hoá Chất độc hại môi trường

Chất độc Chất có khói độc Chất có phóng xạ

Hình 1.2 - Các kỷ hiệu cảnh báo hoá chất nguy hiểm

Trong các cơ quan nghiên cứu và nhà máy sản xuất hoá chất có những vùng

nguy hiểm được cảnh báo bằng các ký hiệu (Hình 1.3), các biển hiệu cấm (Hình 1.4) và

các biên hiệu điều kiện an toàn (Hình 1.5).

A A A A A

A

UAMOKH

OLA t l

4k .4*. A*.

DANGER > INFECTION A

BSBEBSpn [ I

STERILE STERILE STÊRH

A A u«>r. trj?'

Rủi 1*0 sinh học

<- Dễ cháy không mỏ

<r- Nguy hiểm thuỷ tinh vồ

<- Độc với tế bào

<- Độc vái gan

<— Nguy hiểm nhiễm trùng

<- Nguy hiếm nhiễm trùng

<— Mẫu bệnh lý, chú ý dễ hỏng

<” Tiệt trùng

<- Cảnh báo nguyên liệu phóng xạ

0

Vùng có chất độc Nguyên liệu dễ bốc cháy Nguyên liệu dễ nô

Có tia laze Chất ăn mòn Rủi ro sinh học

Hình 1.3 - Ký hiệu cảnh báo các vùng nguy hiểm

Cấm hiit thuốc Câ'm lửa Cấm vào

Cấm đi bộ Cấm dập lửa Nưốc không Cấm dùng găng tay

bằng nước uống được bằng cao su

Hình 1.4 - Các ký hiệu cấm

II

Mũ bảo hiểm Chông ồn Phải rửa tay trước

Phải đi ủng cao su •> + * % Mù. kính báo hiêm, chông ôn Mủ che đâu và mặí

Chỉ được đi bộ Găng tay bảo hiểm có cổ tay Phải có khẩu trang

Phải có găng tay cao su Phải có kính Phải có mặt nạ chống: độc

Tire nearest first box 'm situated— >

Person in ch a rg eflH . J.. . - .....

Dội nưóc khẩn cấp Hộp trợ cứu đầu tiên Rửa mắt TrỢ cứu đầu tién

Hình 1.5 - Các ký hiệu vế điểu kiện an toàn

12

2. Cách sử d ụ n g hoá chất

a) Cần giữ hoá chất sạch

- Chai lọ hoá chất phải cỏ nắp

Trước khi lấy hoá chất phải lau sạch nắp và cô lọ.

- Không clùng lẳn nắp đậy và dụng cụ lấy hoá chất.

- Không dùng hoá chất đã rơi vãi.

h) Hoá c h ấ t (tá p h a

- Lọ hoá chất phải có nhăn ghi tên hoặc công thức hoá học.

- Ghi nồng độ dung dịch.

- Ghi ngày pha.

* Chai lọ đựng hon chất pha phải có nắp.

- Không đê hoá chất rơi vào nhăn.

- Trước khi mớ nắp lọ phải lau sạch nắp và cô lọ.

- Để nấp và dụng cụ lây hoá chất ở nơi sạch, không đế phan tiếp xúc vối hoá chất

xuống bàn.

c) B àn th í n g h iêm

- Chỉ đê hoá chất dang dùng lúc đó.

- Các ho á chất đê bốc hơi, có mùi... phải lấy nhanh hoặc lấy trong tủ hút, phải

đậy kín,

- Khi làm việc vói kiềm, axit và các chất độc phải theo đúng quy (lịnh.

- Không được ngửi hay nếm thử hoá chất.

- Các hoá chất dễ cháy, dễ nô không được để gần lửa.

II. DUNG DỊCH

Dung dịch là hồn hợp nhiều loại của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ vói

nhau về lý, hoá học - thành phần đơn giản nhất của dung dịch có thê tách ra được ớ

dạng t inh khiết, ngược lại có thể điểu chế dung dịch ấy theo một thành phần bất kỳ

dược gọi là thành phần dư trong dung dịch so với thành phần kia là dung môi. Thành

phần còn lại là chất hoà tan.

Ví dụ:

- Dung dịch NaOH 10% trong nước:

NaOH là chất tan, nước là dung môi.

13

- Butanol bão hoà nước:

Nước là chất tan. butanol là dung môi.

111. NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH

Trong phép tính nổng độ dung dịch, các chất tan được biểu thị bằng đơn vị khôi

lượng, khôi lượng moi đương lượng gam (thường được sử dụng), còn sô lượng dung mòi

hoặc dung dịch được biểu thị bằng đơn vị khôi lượng mol hoặc đơn vị thê tích. Trong

nghiên cứu thường dùng 3 nồng độ cơ bản.

- Nồng độ phần trám (%).

- Nồng độ mol/1 (mol - M).

- Nồng độ đương lượng gam (N)

Ngoài ra còn có:

- Nồng độ gam trên lít: sô" gam chất tan có trong một lít

- Nồng độ dung dịch bão hoà: là ở nhiệt độ nhất định, chất hoà tan không thê hoà

tan thêm được nữa. Thường biểu thị bằng sô" gam chất tan trong 1 0 0 ml nước.

1. N ồng độ phần trảm (được chia làm 3 loại n ồn g độ)

- Phần trăm khỏi lượng - khối lượng (% w/w) là sô" gam ciia một. chất hoà tan trong

1 0 0 gam dung dịch.

- Phần trăm khối lượng - thể tích (% w/v) là sô" gam của một chất koà tan trong

1 0 0 ml dung dịch.

- Phần trăm thê tích - thê tích (% v/v) là sô" ml của một chất hoà tan trong 100ml

dung dịch.

Ngoài ra còn có loại nồng độ phần trăm chất hoà tan nhỏ 1000 lần được tính bằng:

+ Miligam phần trăm (mg%) là sô" mg của chất hoà tan trong lOOg hoặc trong

100ml dung dịch (rag/lOOml).

+ Microgam phần trăm (ng%) là sô" microgam (|ig) của chất hoà tan trong 1 0 0 gam

hoặc lOOml dung dịch (Ịig/100ml).

và hai loại nồng độ thường được sử dụng là:

+ Dung dịch phần nghìn (%o) là sô" gam chất hoà tan trong 1000ml dung dịch.

+ Dung dịch phần triệu (ppm) là sô' gam chất tan trong 1.000.000ml dung dịch

hay miligam trong 1 0 0 0 ml dung dịch hoặc microgam trong lml.

a) N ồng độ p h ầ n tră m khôi lương - kh ố i lương (% w /w )

• Chất rắn tan trong chất lỏng

14

+ Chất rắn không ngậm nước

Pha dung dịch từ chất rắn không ngậm nước được tính theo công thức sau:

X = — (1.1)

100

Trong đó:

X - sô gam chất tan lấy đê pha

a - số phần trăm dung dịch muôn pha

b - khối lượng dung dịch cần pha

Ví dụ ỉ: Cần bao nhiêu gam NaCl và bao nhiêu ml nưốc để nhận được 300 gam

đung địch NaCl 15% (w/w)?

Giải: Áp dụng công thức trên ta có:

x = l ^ -3 -9° = 45(g)

100

Đáp so: Để nhận được 300 gam dung dịch NaCl 15% (w/w) cần cân 45 gam NaCl

hoà tan trong 255 gam (ml) nước (300 - 45 = 255).

+ Chất rắn ngậm nước

Muôn pha dung dịch này phải tính cả lượng nưốc ngậm trong phân tử của chất

tan, sau đó tính khôi lượng tổng cộng (khôi lượng chất tan và khổì lượng nưốc ngậm).

Công thức tính:

X = — (1.2)

w

Trong đó: X- sô" gam chất tan lấy pha

a- khôi lượng mol ngậm nước

b- phần trăm dung dịch cần pha

w- khôi lượng phân tử không ngậm nước.

Ví dụ 2: Pha dung dịch Cu s o 4 10% từ C uS0 4 .5H2 0.

Giẩi: Phải tính khôi lượng mol của C1 1 SO4 và CuS0 4 .5H20

CuS0 4 = 159,6 (-160); CuS0 4 .5H20 = 249,7 (-250).

Lắp vào công thức:

X = 25010 =

160

Đáp số: Cần phải cân lõ, 6 g CuSO^.õH.^O và 84,4 gam (ml) nước (100 - 15,6 = 84,4)

ta được dung dịch CuSO ị 10% (w/w).

15

Trong thực tê, khi pha những dung dịch có nồng độ) vài % thì người ta thường

cân chất tan rối cho vào binh định mức hay ông đongr, sau đó thêm nước đên ngàn

muôn pha (vi trong trường họp này thẻ tích mất đi khôrhg đáng kể), cỏng thức tính:

- Chất lỏng tan trong chất lỏng

Chất tan ở đây là chất lỏng và được cân như chất tam và dung môi là nước.

Tính theo công thức:

Ví dụ 3: Pha dung clịch HC1 10% trong nưôc: ta cân dung dịch HC1 rồi láy 100 gam

trừ đi sô gam HC1 là lượng nước thêm vào.

*Chú. ỷ: Các chất lỏng có nồng độ hoà tan tôi đa được tính theo phần trăm. Ví dụ:

lổng này phải tính sô gam chất đó trong dung dịch theo công thức:

100.a

A — —*-------

b

Trong đó: X - khôi lượng chất tan cần có

a - nồng độ dung dịch cần pha

b - nồng độ chất tan hiện có.

Ví dụ 4: Pha dung dịch HC1 10%.

Ta có HC1 đặc là 37%, vậy khối lượng HC1 được tính theo công thức(l.õ):

Như vậy ta phải cân một lượng HC1 là 27,03g, sau đó thêm một lượng nước:

100 - 27,03 = 72,97 (hay 72.97ml nước vì clị|i() = 1 )

Đôi với chất lỏng ta có thê chuyến thành thế tích đe thuận lọi cho pha chê và đước

tinh theo công thức sau:

(1.3)

X = 1 0 0 - a

Trong đó: a - sô gam chất tan

X - số ml nước cần (lùng.

(1.4)

H.,SO | hoà tan tôi đa là 96%, HC1 là 37%, H.,PO.ị là 65% v.v... Vì vậy khi cân các chất

V P

(ỉ (1.6)

16

Trong đó: V- thế tích cần lấy

p - khôi lượng chất tan

d - tỷ khôi chất tan

Vậy thể tích của 27,03 gam HC1 37% có thê tính như sau:

97 0 °,

V = ^ ^ 2 3 ( m l ) (d„n;i7% = U 9 )

b) Phần tră m khôi lương - thê tích (% w/v)

Cân sỏ" gani chất rắn bang sô nồng độ muôi pha cho vào bình định mức hay ông

đong 100ml và cho dung môi đến vạch 100ml. Nếu chất rắn ngậm nước phải cộng

thêm khôi lượng phân tử nước ngậm.

Vi dụ: c ẩ n bao nhiêu gam NaCl đê nhận được 300ml dung địch NaCl 15% (w/v)?

Giái:

lOOml dung dịch có lõg NaCl

300ml dung dịch có Xg NaCl

_ 3 00X lõ

X = ------ -— = 45 (g)

100

Đáp sỏ: Cân 45g NaCl rồi dẫn nưốc đến 300ml.

c) Phần tr ă m thê tích- t h ể tích (% v/v)

- Tính theo nồng độ và th ể tích

Áp dụng công thức:

V1x%1 = v 2y%2 (1.7)

Trong đó: Vì - thê tích dung dịch cần lấy pha

V2 - thê tích dung dịch cần pha

% J - phần trăm dung dịch lây pha

%; - phần trăm dung dịch pha

Vi dụ 1: c ầ n bao nhiêu ml dưng dịch NaCl 27% (w/v) để nhận được 3000ml dung

dịch NaCl 0,9% (w/v).

Giải: Thay vào công thức ta có:

X m l . 27% = 3000ml. 0,9% Ị

x = 3000x09

27 i

"■ . . . . ì

17