Thu nhận và định dạng các chủng Lactobacillus sp. Có lợi từ các nguồn mẫu phân lập khác nhau

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

----------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài:

THU NHẬN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG

Lactobacillus sp. CÓ LỢI TỪ CÁC NGUỒN MẪU PHÂN

LẬP KHÁC NHAU

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4/2013

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài:

THU NHẬN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG

Lactobacillus sp. CÓ LỢI TỪ CÁC NGUỒN MẪU PHÂN

LẬP KHÁC NHAU

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA Nam, Nữ:

Dân tộc: KINH

Lớp, khoa: SH10A3 – Khoa công nghệ sinh học

Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

Ngành học: Công nghệ sinh học vi sinh – sinh học phân tử

Ngƣời hƣớng dẫn:ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4/2013

Trang i

MỤC LỤC

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI.................................................. iv

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN............................................................................................ vii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ ĐỒ THỊ................................................................. viii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH .......................................................................................... ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................... x

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................................ 1

PHẦN I. TỔNG QUAN .......................................................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC ..................................................................... 3

1.2. PHÂN LOẠI VI KHUẨN LACTIC.............................................................................. 4

1.3. QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACID LACTIC [5],[32]....................................................... 4

1.3.1. Cơ chế chung............................................................................................................ 4

1.3.2. Quá trình lên men lactic đồng hình ....................................................................... 5

1.3.3. Quá trình lên men lactic dị hình ............................................................................ 5

1.4. NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN LACTIC..................................................... 6

1.4.1. Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm...................................................... 6

1.4.2. Trong công nghiệp................................................................................................... 7

1.4.3. Trong nông nghiệp và môi trƣờng......................................................................... 8

1.4.4. Trong y dƣợc............................................................................................................ 8

1.5. NHÓM VI KHUẨN Lactobacillus sp............................................................................ 8

1.5.1. Lactobacillus bulgaricus.......................................................................................... 9

1.5.2. Lactobacillus casei.................................................................................................... 9

1.5.3. Lactobacillus lycopersici ........................................................................................ 10

1.5.4. Lactobacillus brevis................................................................................................ 10

1.5.5. Lactobacillus plantarum ........................................................................................ 10

1.5.6. Lactobacillus paraplantarum................................................................................. 11

1.5.7. Lactobacillus acidophillus ..................................................................................... 11

1.5.8. Lactobacillus kefir.................................................................................................. 12

1.5.9. Lactobacillus thermophilus.................................................................................... 12

1.6. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH ...................................................... 12

1.6.1. Phƣơng pháp truyền thống................................................................................... 12

1.6.2. Phƣơng pháp PCR................................................................................................. 14

Trang ii

1.6.3. Thông tin về gen 16S rRNA.................................................................................. 19

1.6.4. Thông tin về gen 23S rRNA.................................................................................. 19

1.6.5. Các công trình nghiên cứu về định danh Lactobacillus dựa trên vùng gen

16S rRNA và 23S rRNA...................................................................................................... 20

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................. 21

2.1.THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI .................................................... 21

2.1.1. Thời gian thực hiện đề tài..................................................................................... 21

2.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài...................................................................................... 21

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU.......................................................................................... 21

2.2.1. Đối tƣợng mẫu nghiên cứu ................................................................................... 21

2.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ............................................................................ 21

2.2.3. Môi trƣờng và thuốc thử dùng trong thí nghiệm ............................................... 22

2.3. PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH SƠ BỘ VI KHUẨN LACTIC ... 22

2.3.1. Cách thu mẫu......................................................................................................... 22

2.3.2. Bố trí thí nghiệm.................................................................................................... 22

2.3.3. Phân lập và làm thuần[20][26]............................................................................. 24

2.3.4. Nhuộm Gram ......................................................................................................... 24

2.3.5. Thử nghiệm catalase ............................................................................................. 25

2.3.6. Thử nghiệm oxidase[20]

.......................................................................................... 26

2.3.7. Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphemen.................................................. 26

2.3.8. Thử khả năng phân giải CaCO3........................................................................... 27

2.3.9. Thử khả năng sinh hơi .......................................................................................... 27

2.3.10. Thử khả năng phát triển ở 150C/450C ............................................................. 27

2.3.11. Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng............................................................. 28

2.3.12. Thử hoạt tính sinh bacteriocins........................................................................ 29

2.3.13. Thử khả năng đông tụ sữa ................................................................................ 30

2.3.14. Dựng đƣờng cong tăng trƣởng ......................................................................... 30

2.4. PHƢƠNG PHÁP KHẢO SÁT IN SILICO................................................................. 32

2.4.1. Thu thập dữ liệu .................................................................................................... 32

2.4.2. Khảo sát in silico.................................................................................................... 32

2.4.2.1. Thu nhận trình tự gen mục tiêu 16S – 23S rRNA ............................................ 32

2.4.2.2. Thu nhận các hệ - cặp mồi................................................................................. 32

2.4.2.3. Phương pháp đánh giá các hệ - cặp mồi ........................................................... 32

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................... 33

Trang iii

3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC..................................................... 33

3.2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO ACID LACTIC, PHÂN GIẢI CANXI

CARBONATE ......................................................................................................................... 36

3.3. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN CỦA CÁC CHỦNG LAB Ở CÁC

NHIỆT ĐỘ 150C VÀ 450C...................................................................................................... 38

3.4. ĐỊNH DANH VI KHUẨN THEO KHÓA PHÂN LOẠI THE PROKARYOTES

– A HANDBOOK ON THE BIOLOGY OF BACTERIA. .................................................. 40

3.5. THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN ....................................................................... 43

3.6. ĐƢỜNG CONG TĂNG TRƢỞNG CỦA LAB.......................................................... 43

3.7. KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ SỮA...................................................................................... 46

3.8. KẾT QUẢ THU THẬP DỮ LIỆU .............................................................................. 47

3.9. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO ............................................................................ 47

3.9.1. Thu nhận trình tự gen mục tiêu 16S – 23S rRNA.............................................. 47

3.9.2. Thu nhận hệ cặp mồi............................................................................................. 48

3.9.3. Đánh giá hệ cặp mồi .............................................................................................. 49

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................... 57

4.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................... 57

4.2. ĐỀ NGHỊ....................................................................................................................... 57

PHỤ LỤC ..................................................................................................................................... 64

Trang iv

1 THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: “Thu nhận và định danh các chủng Lactobacillus sp. có lợi từ

các nguồn mẫu phân lập khác nhau”.

- Sinh viên thực hiện 1 (Nhóm trƣởng): NGUYỄN TRỌNG NGHĨA

- Lớp: SH10A3 Khoa:CNSHNăm thứ: 3Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 2 (Thành viên 1): NGUYỄN THỊ THU NGÂN

- Lớp: SH10A3 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 3 (Thành viên 2): PHẠM THỊ BÍCH NGÂN

- Lớp: SH10A3 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

2. Mục tiêu đề tài:

 Khảo sát phân lập và định danh các chủng vi khuẩn Lactobacillus có lợi từ các

nguồn thực phẩm khác nhau nhằm thu nhận các chủng vi khuẩn lactic khác nhau:

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis,..

 Khảo sát đặc tính có lợi của các chủng vi khuẩn lactic thu đƣợc ở mức độ định

tính: khảo sát khả năng lên men lactic, đông tụ sữa, khả năng sinh bacteriocins.

 Xây dựng quy trình PCR- giải trình tự vùng gen mục tiêu (gene 16S rRNA,…)

và phân tích phả hệ, xác định phát sinh chủng loài của nhóm vi khuẩn lactic ứng dụng

trong việc định danh chính xác vi khuẩn Lactobaillusspp.

3. Tính mới và sáng tạo:

 Thu nhận những chủng vi khuẩn lactic có lợi, hƣớng đến việc tạo các

nguồn giống vi khuẩn lactic có những đặc điểm có lợi, phục vụ cho lĩnh vực

công nghệ sinh học ứng dụng trong chế biến thực phẩm.

4. Kết quả nghiên cứu:

Trang v

 Dựa vào phƣơng pháp truyền thống, chúng tôi đã thu nhận đƣợc các

chủng Lactobacillus sp. dự tuyển có lợi: L. brevis (C61); L. crispatus (D15); L.

fermentum (C21); L. negelli (C26, C28, D31, D61, D63); L. paraplantarum

(C51, C54, D11, D43, G17, G36, G42, M11, M21). Các chủng này đƣợc lƣu trữ

tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - trƣờng Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh.

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát đƣợc đƣờng cong tăng trƣởng của chủng vi

khuẩn Lactobacillus paraplantarum dự tuyển, đồng thời chúng tôi còn xác định

đƣợc hoạt tính kháng khuẩn của chủng L. paraplantarum dự tuyển đối với vi

khuẩn gây bệnh (E. coli) cũng nhƣ là khả năng đông tụ sữa của chủng L.

paraplantarum dự tuyển.

 Chúng tôi đã tiến hành khảo sát in silico, thu thập các cặp mồi khuếch đại

trên vùng 16S rRNA trên các bài báo khoa học, đồng thời tiến hành phân tích

đánh giá các thông số quan trọng (chiều dài mồi, thành phần GC, nhiệt độ nóng

chảy, khả năng hình thành cấu trúc kẹp tóc, primer-dimer,…) để thu nhận đƣợc

các cặp mồi đặc hiệu hƣớng đến phần nghiên cứu thực nghiệm: xây dựng quy

trình với phản ứng PCR kết hợp với phƣơng pháp giải trình tự nhằm hỗ trợ định

danh chính xác các loài vi khuẩn lactic thu nhận đƣợc.

5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội,giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc

phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

Sử dụng các chủng vi khuẩn nêu trên để phục vụ cho những nghiên cứu: ứng

dụng vi khuẩn lactic trong chế biến thực phẩm và thu nhận các sản phẩm trao

đổi chất bậc II (Bacteriocin,…) có nguồn gốc từ vi khuẩn lactic để làm chất bảo

quản thực phẩm.

6.Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài:

Ngày 22 tháng 4 năm 2013

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

thực hiện đề tài

Nguyễn Trọng Nghĩa

Trang vi

 Nhận xét của ngƣời hƣớng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh

viên thực hiện đề tài:

 Nhóm sinh viên thực hiện đề tài nghiên cứu do sinh viên Nguyễn Trọng

Nghĩa làm trƣởng nhóm đã thực hiện tốt nội dung công việc do giảng viên

hƣớng dẫn giao cho.

 Các sinh viên trong nhóm nghiên cứu đã thể hiện tính tích cực chủ động

và trách nhiệm trong quá trình nghiên cứu đề tài và biết cách làm việc

nhóm.

 Sinh viên biết cách thu thập tài liệu, chọn lọc và xử lý thông tin để lựa

chọn các loại mẫu (kim chi, cải chua,…), dựa vào phƣơng pháp vi sinh

truyền thống để tìm ra cách thu nhận và sàng lọc các chủng vi khuẩn

lactic cũng nhƣ tìm hiểu các đặc tính có lợi của các chủng dự tuyển và đặc

điểm về quá trình sống của các chủng vi khuẩn này. Từ đó, nhóm nghiên

cứu thu thập đƣợc bộ chủng vi khuẩn lactic có lợi ứng dụng cho công

nghệ thực phẩm.

 Sinh viên đảm bảo các kỹ năng thao tác trong phòng thí nghiệm phân tích

vi sinh theo hƣớng truyền thống. Đồng thời, sinh viên thể hiện tính chịu

khó học hỏi để ứng dụng các công cụ tin sinh học để sàng lọc và thu thập

các cặp mồi khuếch đại vùng gene 16S rRNA nhằm hƣớng đến việc xây

dựng quy trình PCR kết hợp giải trình tự để định danh các chủng vi khuẩn

lactic dự tuyển.

Ngày 22 tháng 4 năm 2013

Xác nhận của đơn vị Ngƣời hƣớng dẫn