Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB3 điều khiển tính chống chịu của cây đậu tương [Glycine Max (L.) Merrill]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠ I HỌ C THÁI NGUYÊN

TRƢỜ NG ĐẠ I HỌ C SƢ PHẠ M

BÀNH THỊ MAI ANH

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ

HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG

CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LUẬ N VĂN THẠ C SĨSINH HỌ C

THÁI NGUYÊN - 2011

1

ĐẠ I HỌ C THÁI NGUYÊN

TRƢỜ NG ĐẠ I HỌ C SƢ PHẠ M

LUẬ N VĂN THẠ C SĨSINH HỌ C

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ

HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU

CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62.42.70

Học viên: Bành Thị Mai Anh

Người hướng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Hà

THÁI NGUYÊN - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công

trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ

bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn

thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn , TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Lê Thu

Ngọc cùng toàn thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thực vật , Viện Công nghệ Sinh học

đã tận tình giúp đỡ cho tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-KTNN và khoa Sau đại học, trƣờng Đại học

Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di

truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá

trình học tập và nghiên cứu đề tài.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá

trình học tập và thực hiện thành công luận văn này.

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2011

Học viên

BÀNH THỊ MAI ANH

i

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan..............................................................................................................

Lời cảm ơn..................................................................................................................

Mục lục....................................................................................................................... i

Danh mụ c chƣ̃ viết tắt................................................................................................. iv

Danh mụ c bảng........................................................................................................... vi

Danh mụ c hình............................................................................................................ vii

MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 1

I. Đặt vấn đề................................................................................................................ 1

II. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………........... 2

III. Nộ i dung nghiên cƣ́u…………………………………………………………..... 2

Chƣơng 1. TỔ NG QUAN TÀI LIỆ U…………………………………………….. 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƢƠNG……………………………………... 3

1.1.1. Nguồn gốc phân loại cây đậu tƣơng…………………………………………. 3

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng………………….................................. 3

1.1.3. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng...................................................................... 5

1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam.............................. 6

1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬ U TƢƠNG………........... 7

1.3. CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN………………… 11

1.3.1. Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn……………………………........... 11

1.3.2. Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen liên quan đến tính chịu hạn……… 12

ii

1.3.3. Promoter rd29A……………………………………………………………..... 15

1.4. NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB…………………………….... 18

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U.............................. 24

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ............................................................... 24

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 25

2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử...................................................................... 25

2.2.1.1. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA………………………….. 25

2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA……………………………………………… 26

2.2.1.3. Phản ứng PCR ……………………………………...................................... 27

2.2.1.4. Phương pháp tách dòng gen……………………………………………….. 27

2.2.1.5. Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3………………………………. 29

2.2.2. Phƣơng pháp tái sinh và chuyển gen thông qua Agrobacterium................ 30

2.2.2.1. Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thông qua Agrobacterium..... 30

2.2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium....... 32

2.2.3. Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen....................................................... 33

2.2.3.1. Phương pháp PCR......................................................................................... 33

2.2.3.2. Phương pháp gây hạ n nhân tạ o..................................................................... 33

2.2.4. Phƣơng pháp tính toán và xử lý số liệu......................................................... 33

2.2.5. Phƣơng pháp xƣ̉ lý trình tƣ̣ gen và amino acid............................................ 33

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ N…………………………………........... 34

3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÕNG GEN DREB3…………………………………….. 34

iii

3.1.1. Kết quả nhân gen DREB3 tƣ̀ RNA tổng số giống đậu tƣơng Nâu Cao Bằng.... 34

3.1.2. Kết quả ghép nối đoạn gen DREB3 vào vector tách dòng …………………... 35

3.1.3. Phân tích và xếp nhóm protein DREB3 dƣ̣ a vào vùng bảo thủ AP2…………. 39

3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN DREB3 ……………….. 42

3.2.1. Thiết kế vector ………………………………………………………………. 42

3.2.2.Biến nạp cấu trúc vector pBI 101::rd29A::DREB3 vào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens………………………………………….......................

47

3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN DREB3 VÀO CÂY THUỐC LÁ THÔNG

QUA AGROBACTERIUM………………………………………………………..

48

3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc vector pBI::rd29A::DREB3 vào giống thuốc lá

K326………………………………………………………………………………….

48

3.3.2. Kết quả phân tích và đánh giá các dòng thuốc lá thu đƣợ c………………. 50

3.4. KẾT QUẢ CHUYỂN PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬ U

TƢƠNG……………………………………………………………………………..

52

3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng…………………… 52

3.4.2. Kết quả phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR……............ 55

KẾT LUẬ N VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………………........... 56

DANH MỤ C CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬ N VĂN………………… 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 58

PHỤ LỤC…………………………………………………………………………..