Tách dòng và biểu hiện Lignin Peroxidase Isozyme H8 của Phanerochaete Chrysosporium trong nấm men Pichia Pastoris

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

******************

VŨ VĂN LỢI

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE

ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM

TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội - 2012

1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

****************

VŨ VĂN LỢI

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN LIGNIN PEROXIDASE

ISOZYME H8 CỦA PHANEROCHAETE CHRYSOSPORIUM

TRONG NẤM MEN PICHIA PASTORIS

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Mã số: 62 42 40

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. PHÍ QUYẾT TIẾN

Hà Nội – 2012

2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

i

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Phí Quyết Tiến và TS. Phạm Thị

Bích Hợp, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài

nguyên sinh vật đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học.

Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Hồng Thảo và các cán bộ Phòng Công nghệ

lên men, Viện Công nghệ sinh học đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài này.

Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa Học và Công nghệ

Việt Nam, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen Quốc gia, nơi tôi làm việc, đã tạo

điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: CNHD.ĐT.004/08-1

ĐT.07.08/CNSHCB thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực

công nghiệp chế biến đến năm 2020.

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn động

viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Vũ Văn Lợi

3Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu

và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được

ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Một số số liệu đã được đăng trên

các tạp chí khoa học chuyên ngành như trong: “Danh mục công trình khoa

học đã công bố có liên quan đến luận án”, đã được sự đồng ý cho phép sử

dụng các số liệu của các đồng tác giả và phần còn lại là các kết quả như trong

luận án.

Hà nội, ngày tháng năm 2012

Học viên

Vũ Văn Lợi

4Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT Từ viết tắt Tên đầy đủ

1 bp Cặp bazơ (base pair)

2 cDNA DNA bổ trợ (Complementary DNA)

3 DEPC Diethyl pyrocarbonate

4 his Histidine dehydrogenase

5 DNA Deoxyribonucleic acid

6 dNTP Deoxynucleotide

7 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid

8 EtBr Ethidium bromide

9 kb Kilo bazơ

10 kDa Kilo Dalton

11 LiP Lignin peroxidase

12 LiP H8 Lignin peroxidase isozyme H8

13 rLiP H8 Lignin peroxidase isozyme H8 tái tổ hợp

14 mRNA ARN thông tin (messenger RNA)

15 OD Mật độ quang (Optical Density)

16 ORF Khung đọc mở (Open Reading Frame)

17 PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain

reaction)

18 pI Điểm đẳng điện (isoelectric point)

19 RNA Ribonucleic acid

20 rRNA ARN ribosom

21 RT-PCR Phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase

(Reverse transcription polymerase chain reaction)

22 SDS Sodium dodecyl sulfate

23 SDS-PAGE Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium doecyl

sulfate

24 TAE Tris-acetat EDTA

25 TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine

26 tRNA ARN vận chuyển

5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

iv

DANH MỤC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

2.1 Thành phần gel chạy SDS-PAGE 29

3.1 So sánh độ tương đồng của trình tự amino acid giữa các LiP

H8 từ P. chrysosporium

38

3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy tới hoạt tính rLiP H8

của chủng P. pastoris C132

44

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ methanol cảm ứng đến khả năng

phát triển và sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris

C132

47

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men trong môi trường đến

khả năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132

48

3.5 Ảnh hưởng của nồng độ peptone trong môi trường đến khả

năng sinh tổng hợp rLiP H8 của chủng P. pastoris C132

49

3.6 Ảnh hưởng của thành phần YNB và ammonium sulfate đến

hoạt tính rLiP H8.

50

6Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

v

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1 Các tiểu phần cấu tạo nên phân tử lignin 3

1.2 Cấu trúc hoá học tiêu biểu của lignin 4

1.3 Sự phân cắt liên kết Cα-Cβ và β-O-4 ở các tiểu phần của

polymer lignin, tạo thành các oligomer

5

1.4 Cơ chế phân cắt mối liên kết C-C tạo thành gốc aryl 6

1.5 Cơ chế xúc tác của laccase 7

1.6 Nguyên lý của quá trình tích hợp gen ngoại lai vào locus

his4

14

3.1 Điện di đồ sản phẩm RNA tổng số và sản phẩm cDNA của

nấm đảm P. chrysosporium 36210

33

3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen lipH8 và plasmid

pCR2.1::lipH8 trên gel agarose 1,0%

35

3.3 So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen lipH8 từ

chủng P. chrysosporium 36210 với trình tự amino acid của

các protein tương ứng từ các chủng P. chrysosporium khác

được đăng ký trên GenBank

36

3.4 Cây phân loại thể hiện sự tương đồng về trình tự amino acid

suy diễn của LiP H8 từ chủng P. chrysosporium 36210 và

các trình tự LiP H8 tương ứng của các chủng P.

chrysosporium khác

38

3.5 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pPIC9::lipH8 bằng hai

enzyme giới hạn

39

3.6 Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của gen lipH8 với khuôn 40

7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

vi

DNA là bộ gen của P. pastoris tái tổ hợp

3.7 Điện di đồ protein dịch nuôi cấy của năm dòng P. pastoris

tái tổ hợp trên SDS-PAGE gel

42

3.8. Hoạt tính rLiP H8 của các dòng P. pastoris tái tổ hợp sau

84 giờ nuôi cấy

43

3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện rLiP H8

của chủng P. pastoris C132

45

3.10 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rLiP H8 bởi

chủng P. pastoris C132 trong bình lên men tự động Bioflo

110 dung tích 7,5 lít

51

3.11. Hoạt tính rLiP H8 từ chủng P. pastoris C132 trước và sau

quá trình tối ưu

52

3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8

sinh tổng hợp bởi P. pastoris C132

53

3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ xúc tác của rLiP H8 sinh

tổng hợp bởi P. pastoris C132

54

3.14 Độ bền của rLiP H8 của chủng P. pastoris C132 khi ủ ở các

nhiệt độ khác nhau theo thời gian

55

3.15 Độ bền của rLiP H8 ở các pH khác nhau theo thời gian 55

8Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn