Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam

Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã

hóa cho thụ thể neurokinin-1 ở người Việt Nam

Lê Hồng Thu

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30

Người hướng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về G protein; họ tachykinin ở động vật có vú; thụ thể họ tachykinin

và thụ thể neurokinin-1; ứng dụng của thụ thể neurokinin-1 trong điều trị bệnh; vector

biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1. Trình bày nguyên liệu và phương pháp

nghiên cứu: Tách RNA tổng số; phản ứng phiên mã ngược; phản ứng PCR (Polymerase

Chain Reaction); Tinh sạch DAN bằng phương pháp thôi gel; nối ghép các đoạn DNA

vào vector; kỹ thuật biến nạp; sàng lọc khuẩn lạc; tách plasmid kĩ thuật cắt sử dụng

enzyme giới hạn; ký thuật điện di; phân tích trình tự cDnA của cDNA-NK1. Đưa ra kết

quả và thảo luận: Tách dòng gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ phổi người; thiết kế

vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.

Keywords: Sinh học thực nghiệm; Gen mã hóa; Người Việt Nam; Thụ thể

neurokinin-1; Cấu trúc protein

Content

MỞ ĐẦU

Thụ thể neurokinin – 1 thuộc nhóm các thụ thể xuyên màng liên kết với G protein. Khi thụ thể

này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh

ngoại vi về trung ương thần kinh, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm, mặt

khác chúng cũng có tác dụng gây kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của

cơ thể.

Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của thụ thể neurokinin-1, các hãng dược

phẩm đã cố gắng tìm ra các chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau

cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho các bệnh

nhân ung thư, … Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu về thụ thể này ở người Việt Nam còn rất

ít hoặc chưa được công bố. Chính vì vậy, với mục đích phân lập được đoạn cDNA hoàn chỉnh

mã hóa cho thụ thể này ở người Việt Nam và biểu hiện chúng trên hệ thống tế bào động vật để có

thể chủ động được nguồn gen và các hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam,

chúng tôi đã tiến hành đề tài “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho thụ thể

neurokinin-1 ở ngườiViệt Nam”. Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh

học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein và

Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống,Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN

1.1.1. G protein

G protein lần đầu tiên được phát hiện và mô tả bởi Alfred và Martin khi hai ông nghiên cứu tác

động của adrenaline đối với tế bào. Với công trình này, hai ông đã giành giải Nobel lý sinh – y

học năm 1994 [4].

G protein định vị ở mặt trong màng tế bào và được hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein

(GPCRs) phân bố trên bề mặt màng tế bào.

1.1.2. Thụ thể liên kết với G protein

Họ thụ thể liên kết với G protein là những phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine)

[45], được phân thành các phân họ khác nhau dựa theo độ tương đồng về trình tự acid amine,

chức năng và khả năng liên kết với các cấu tử. Đến nay đã người ta đã phát hiện ra 367 thụ thể

liên kết với G protein ở người, trong đó có khoảng 150 GPCRs được tìm thấy vẫn chưa biết chức

năng [52].

1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ

Tachykinin là một trong những họ neuropeptide lớn nhất được tìm thấy trong cơ thể của tất cả

các loài động vật. Có hơn 40 loại tachykinin đã được phân lập từ các nhóm động vật không

xương và có xương sống [15, 45].

Trong họ tachykinin, chất P (SP) được mô tả lần đầu tiên năm 1931 bởi Euler và Gaddum

khi hai ông nghiên cứu dịch chiết não và ruột ngựa trong cồn. Dịch chiết này có tác dụng kích

thích hiệu quả hoạt động của ruột và gây giảm huyết áp ở thỏ [21]. Tuy nhiên, rất nhiều thí

nghiệm nhằm phân lập và tinh sạch SP có hoạt tính từ các mẫu ruột ngựa đã không thành công.

Bốn mươi năm sau đó (năm 1970), Chang và Leeman mới tinh sạch được SP từ vùng dưới đồi