Tách Dòng Đoạn Gen Mã Hóa Kháng Nguyên Neuraminidase Của Chủng Vi Rút Cúm A H 5 N 1 Tạo Nguồn Nguyên Liệu Sản Xuất Vắc Xin Cúm Gia Cầm

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

-----------o0o------------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÁCH DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN

NEURAMINIDASE CỦA CHỦNG VI-RÚT CÚM A/H5N1 TẠO

NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC – XIN CÚM GIA CẦM

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: D420201

Hà Nội, 2018

Giảng viên hƣớng

dẫn

:TS. Nguyễn Trung Nam

: ThS. Nguyễn Hùng Chí

Sinh viên thực hiện : Hồ Thị Ngọc

Mã sinh viên : 1453070137

Lớp : 59B-CNSH

Khóa học : 2014 -2018

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, trƣớc tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc

nhất tới TS. Nguyễn Trung Nam - Trƣởng phòng Công Nghệ ADN ứng

dụng,Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt

Nam - Ngƣời đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi đƣợc nghiên cứu và thực hiện

khóa luận tại phòng. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths.Nguyễn Hùng Chí

– ngƣời luôn tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

khóa luận. Trong thời gian thực tập lãnh đạo và cán bộ trong phòng đã giúp

tôi trƣởng thành hơn rất nhiều.

Tôi xin gửi lời biết ơn đến toàn thể quý Thầy, Cô giáo tại Viện Công nghệ

sinh học Lâm Nghiệp đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học

vừa qua. Đồng thời tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ths.Nguyễn Thị Thu

Hằng và các thầy cô giáo trực tiếp tham gia giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt

quá trình học tập tại trƣờng.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với ngƣời thân, bạn bè, những ngƣời luôn

sát cánh cùng tôi, động viên, khích lệ tôi tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn

thành đƣợc khóa luận này.

Cuối cùng tôi xin kính chúc quý Thầy, Cô, gia đình và bạn bè dồi dào sức

khỏe và thành công trong cuộc sống.

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 13 tháng 5 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Hồ Thị Ngọc

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................i

MỤC LỤC.........................................................................................................ii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT............................................................................ v

DANH MỤC BẢNG........................................................................................vi

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................vii

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU................................... 3

1.1. Tổng quan về vi-rút cúm A........................................................................ 3

1.1.1. Khái quát và phân loại vi-rút cúm A....................................................... 3

1.1.2. Danh pháp vi-rút cúm.............................................................................. 4

1.1.3. Cấu trúc vi-rút cúm A ............................................................................. 4

1.1.4. Cơ chế xâm nhiễm của vi-rút cúm A/H5N1 trong tế bào chủ ................ 7

1.1.5. Khả gây bệnh của vi-rút cúm A .............................................................. 9

1.2. Kháng nguyên NA của vi-rút cúm........................................................... 10

1.2.1. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của kháng nguyên NA........................... 10

1.2.2. Vai trò của kháng nguyên NA............................................................... 12

1.3. Giới thiệu về vắc -xin phòng chống cúm A/H5N1 .................................. 13

1.3.1. Nguyên tắc chung của việc phát triển chủng dự tuyển vắc-xin phòng

chống cúm A/H5N1 ........................................................................................ 13

1.3.2. Các chủng vi-rút vắc-xin dự tuyển........................................................ 13

1.3.3. Khuyến cáo cho việc sử dụng các chủng dự tuyển vắc-xin.................. 14

1.3.4. Điều trị và dự phòng ............................................................................. 14

1.4. Các phƣơng pháp giải trình tự gen........................................................... 15

1.4.1. Giải trình tự gen theo phƣơng pháp Maxam và Gilbert........................ 15

1.4.2. Giải trình tự gen theo phƣơng pháp dideoxy của Sanger ..................... 15

1.4.3. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự tự động .......................... 15

iii

CHƢƠNG 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU................................................................................................................. 17

2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 17

2.2. Nội dung nghiên cứu................................................................................ 17

2.3. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu................................................................. 17

2.3.1.Đối tƣợng ............................................................................................... 17

2.3.2. Vật liệu .................................................................................................. 17

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 19

2.4.1. Phƣơng pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli DH5............ 20

2.4.2. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%............................................. 20

2.4.3. Phƣơng pháp gắn sản phẩm PCR vào vector pHW2000 ...................... 21

2.4.4. Phƣơng pháp PCR khuếch đại đoạn gen NA........................................ 22

2.4.5. Tách chiết DNA plasmid....................................................................... 23

2.4.6. Tinh sạch plasmid tái tổ hợp ................................................................. 23

2.4.7. Phƣơng pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động..... 24

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 26

3.1. Kết quả thiết kế gen NA-N1 của chủng vi-rút cúm A H5/N1 clade

2.3.2.1C và clade 1.1....................................................................................... 26

3.2. Kết quả nhân dòng đoạn gen NA – N1 của chủng vi-rút cúm H5N1 clade

2.3.2.1C vào vector tách dòng......................................................................... 28

3.2.1. Nhân gen NA clade 2.3.2.1C ................................................................ 28

3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp pHW 2000 –NA clade 2.3.2.1C vào tế bào

khả biến E.Coli chủng DH5.......................................................................... 29

3.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen NA –N1 trong vector pHW2000.... 30

3.3.1. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen NA............................. 30

3.3.2. Kiểm tra bằng phản ứng cắt vector tái tổ hợp với enzym giới hạn....... 31

3.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen NA – N1 trong vector pHW2000............ 32