Tách Dòng Đoạn Gen Mã Hóa Kháng Nguyên Hemagglutinin Của Chủng Vi Rút Cúm A H 5 N 1 Tạo Nguồn Nguyên Liệu Sản Xuất Vắc Xin Cúm Gia Cầm

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

“TÁCH DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN

HEMAGGLUTININ CỦA CHỦNG VI-RÚT CÚM A/H5N1 TẠO NGUỒN

NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN CÚM GIA CẦM”

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH: D420201

Giảng viên hƣớng dẫn : TS. Nguyễn Trung Nam

Th.S Nguyễn Hùng Chí

Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Tƣơi

Mã sinh viên : 1453070008

Khóa học : 2014 - 2018

HÀ NỘI, 2018

LỜI CẢM ƠN

Để có đƣợc điều kiện thực hiện hoàn thành tốt Khóa Luận Tốt Nghiệp

trƣớc hết em xin gửi đến thầy TS. Nguyễn Trung Nam - Trƣởng phòng Công

nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam; Th.S Nguyễn Hùng Chí – phòng Công nghệ ADN ứng

dụng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc vì đã

tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thiện đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong phòng công nghệ ADN ứng

dụng, cùng với ban lãnh đạo viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn Lâm và Khoa

học Công nghệ Việt Nam đã tạo ra môi trƣờng trƣờng nghiên cứu và học tập tốt

cho sinh viên chúng em.

Em xin gửi đến quý thầy, cô giáo trong Viện Công Nghệ Sinh Học trƣờng

Đại Học Lâm Nghiệp lời cảm ơn chân thành. Đặc biệt, em xin gởi đến cô Th.S

Nguyễn Thị Thu Hằng – trƣởng bộ môn Vi Sinh - Hóa sinh ngƣời đã nhiệt tình

giúp đỡ và giải đáp những khúc mắc khó khăn cho em trong quá trình thực hiện

đề tài này.

Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp đã

tạo tạo điều kiện cho em hoàn thành quá trình học tập và rèn luyện sau 4 năm

học.

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những ngƣời thân trong

gia đình và bạn bè, những ngƣời đã luôn ở bên em, chăm sóc, động viên em

trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.

Trong quá trình thực hiện đề tài em đã không ngừng cố gắng phấn đấu và

nỗ lực. Nhƣng vì kiến thức bản thân còn hạn chế, trong quá trình học tập, hoàn

thiện đề tài này khó tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận đƣợc những ý

kiến đóng góp từ thầy cô để bài khóa luận của em đƣợc hoàn thành tốt hơn.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 02 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Tƣơi

Đỗ Thị Tƣơi

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ..................................... 2

1.1. Cúm A/H5N1............................................................................................... 2

1.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................................... 2

1.1.2. Thực trạng dịch bệnh cúm A/H5N1 ......................................................... 3

1.2. Vi-rút cúm A/H5N1..................................................................................... 4

1.2.1. Nguồn gốc phát sinh................................................................................. 4

1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và bộ gen của vi-rút cúm............................ 5

1.2.4. Cấu trúc, đặc tính và vai trò của gen HA-H5 trong sự xâm nhiễm và tái

bản của vi-rút cúm A/H5N1................................................................................ 10

1.3. Tách dòng gen và kỹ thuật di truyền ngƣợc trong sản xuất vắc-xin ......... 13

1.4. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc-xin cúm gia cầm ở Việt Nam........ 14

1.5. Ứng dụng công nghệ gen trong nghiên cứu tách dòng gen của vi-rút cúm

A/H5N1 ............................................................................................................... 15

1.5.1. Tin sinh trong phân tích di truyền .......................................................... 15

1.5.2. Vector sử dụng trong kỹ thuật di truyền................................................. 17

1.5.3. Một số phƣơng pháp giải trình tự gen .................................................... 18

CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU20

2.1. Mục tiêu ..................................................................................................... 20

2.2. Nội dung nghiên cứu.................................................................................. 20

2.3. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu .............................................................. 20

2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.............................................................. 21

2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 22

2.5.1. Phƣơng pháp thiết kế và sinh tổng hợp gen HA-H5 của vi-rút cúm

A/H5N1 ............................................................................................................... 23

2.5.2. Phƣơng pháp tách dòng đoạn gen HA đã loại bỏ đoạn độc vào vector

pHW2000 ............................................................................................................ 24

2.5.3. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào Escherichia coli ........ 25

2.5.4. Phƣơng pháp chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc............................................ 26

2.5.5. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch ADN tái tổ hợp ............................ 27

2.5.6. Phƣơng pháp kiểm tra kết quả tách dòng gen HA-H5 bằng phản ứng cắt

với enzyme giới hạn ............................................................................................ 27

2.5.7. Phƣơng pháp giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động ....... 28

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................ 29

3.1. Kết quả sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế gen HA-H5 không chứa

đoạn độc của vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 C.............................................. 29

3.2. Kết quả tách dòng đoạn gen HA-H5 không chứa đoạn độc của chủng vi-rút

cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000. .......................................... 31

3.2.1. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng

DH5α ................................................................................................................... 31

3.2.2. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen HA-H5 bằng phản ứng PCR với mồi

đặc hiệu................................................................................................................ 32

3.2.3. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen HA-H5 bằng phản ứng cắt với

enzyme giới hạn .................................................................................................. 33

3.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen HA-H5 trong vector tách dòng ................... 34

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 36

4.1. Kết luận ........................................................................................................ 36

4.2. Kiến nghị...................................................................................................... 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 37

Tài liệu tham khảo Tiếng Việt ............................................................................ 37

Tài liệu tham khảo Tiếng Anh ............................................................................ 38