Phát hiện đoạn gen eip18 của chủng Edwardsiella ictaluri ATCC 33202 bằng phƣơng pháp LAMP (Loop mediated isothermal amplifications

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

…………..o0o…………..

Lê Nguyễn Nguyên Hạ

PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG

Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP

LAMP (Loop – mediated isothermal amplification)

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60.42.40

LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRƯƠNG NAM HẢI

Hà Nội, 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

…………..o0o…………..

Lê Nguyễn Nguyên Hạ

PHÁT HIỆN ĐOẠN GEN ELIP 18 CỦA CHỦNG

Edwarasiella ictaluri ATCC 33202 BẰNG PHƯƠNG PHÁP

LAMP (Loop – mediated isothermal amplification)

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60.42.40

LUẬN ÁN THẠC SỸ KHOA HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS TRƯƠNG NAM HẢI

Hà Nội, 2010

1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, trong 10 năm trở lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất

nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long nhƣ An Giang,

Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang với mục đích xuất khẩu sang các nƣớc

nhƣ Mỹ và Châu Âu. Việc thâm canh hóa trong nuôi cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus), đặc biệt là nuôi với mật độ cao và chƣa có những biện pháp quản

lý dịch bệnh hợp lý đã làm cho dịch bệnh xảy ra thƣờng xuyên hơn và gây thiệt hại

nhiều hơn. Một trong những bệnh truyền nhiễm đã và đang gây thiệt hại nghiêm

trọng đến năng suất và sản lƣợng cá nuôi là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây nên. Tỉ lệ xuất hiện bệnh mủ gan trên cá tra khoảng 61%,

nhƣng tỷ lệ chết đến 60 - 80%, làm giảm năng suất đáng kể trong các hệ thống nuôi.

Hiện nay chƣa có vaccine phòng bệnh này một cách hiệu quả, do đó việc

phát hiện sớm tác nhân gây bệnh đóng vai trò quan trọng trong phòng chống, kiểm

soát và điều trị bệnh cho cá, ao nuôi nhằm hạn chế tối thiểu thiệt hại về kinh tế cho

bà con. Thông thƣờng, để phát hiện một tác nhân gây bệnh bằng phƣơng pháp vi

sinh trong phòng thí nghiệm thƣờng mất từ 3 đến 7 ngày, đối với phƣơng pháp PCR

truyền thống có thể từ 3 đến 4 giờ, đối với phƣơng pháp ELISA có thể từ 1 đến 2

ngày. Các phƣơng pháp này không nhanh nhạy, lại khó thao tác, phức tạp và có chi

phí cao. Trong khi đó, LAMP là một phƣơng pháp chẩn đoán mới, nhanh nhạy, phát

hiện chính xác tác nhân gây bệnh với khả năng ứng dụng nhanh bên ngoài phòng thí

nghiệm. Đứng trƣớc tình hình đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện đoạn gen

eip18 của chủng Edwardsiella ictaluri ATCC 33202 bằng phƣơng pháp LAMP

(Loop mediated isothermal amplifications)” với mục đích xây dựng phƣơng pháp

để phát triển hƣớng tạo kit phát hiện một số tác nhân gây bệnh.

2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VI KHUẨN Edwardsiella

Edwardsiella là một trong những chi mới thuộc họ Enterobacteriaceae, lần

đầu tiên đƣợc phân lập và phân loại bởi nhà khoa học ngƣời Mỹ P.R Edwards

(1901-1966) [16, 28]. Chi Edwardsiella gồm 3 loài: E. tarda, E. ictaluri, E.

hoshinae, trong đó E. ictaluri đƣợc tìm thấy muộn nhất. Chi Edwardsiella mang các

đặc điểm điển hình của họ Enterobacteriaceae: vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng,

nhỏ, kích thƣớc 1 × 2 - 3 µm, không hình thành bào tử, không di động hoặc di động

bằng tiên mao, hô hấp kị khí tùy tiện. Kích thƣớc khuẩn lạc trên môi trƣờng cơ sở

sau 24 giờ nuôi cấy rất nhỏ chỉ từ 0,5 đến 1 mm) [12, 32].

Hình 1.1. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dƣới kính hiển vi điện tử (A) và

nhuộm Gram (B) (http://www.micro-gen.ouhsc.edu)

Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu của chi Edwardsiella là 370C, trừ E. ictaluri, phát

triển ở nhiệt độ thấp hơn 28-30oC. Trong quá trình tăng trƣởng cần bổ sung

nicotinamide và acid amin, khử nitrat thành nitrit. Lên men D-glucose cho sản phẩm

là các acid và các khí thông thƣờng khác. Ngoài ra còn có thể lên men một số

carbohydrate khác nhƣng không lên men đƣợc nhiều nhƣ các chi khác thuộc họ

Enterobacteriaceae. Vi khuẩn thƣờng phân lập đƣợc từ các loài cá sông, các loài

động vật máu lạnh và môi trƣờng sống của chúng, đặc biệt là nƣớc ngọt. Chúng gây

bệnh cho cả động vật máu nóng nhƣ: chó, lợn, bò, khỉ, chuột, chồn hôi, sƣ tử biển…

nhƣng vai trò gây bệnh ở các đối tƣợng này chƣa đƣợc biết đến nhiều. Hầu hết

ngƣởi ta chỉ quan tâm đến tác hại gây bệnh của vi khuẩn thuộc chi này trên cá, đặc

A B

3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

biệt là cá da trơn do mức độ nguy hiểm về khả năng bùng phát thành dịch với mức

độ thiệt hại về kinh tế khá lớn [12].

Vi khuẩn thuộc chi Edwardsiella có khả năng đ ề kháng v ới colistin và

polimycin B nhƣng lại khá nhạy cảm với mộ t số tác nhân kháng vi sinh vật thông

thƣờng nhƣ penicillin G , ampicillin, carbenicillin, streptomycin, kanamycin,

gentamicin, tetracycline, chloramphenicol, cephalosporins, sulfadiazine, exceptions

và nalidixic acid [7, 12]. Tuy nhiên, Waltman và đtg (1986) đã báo cáo về khả năng

kháng mạnh các hợp chất lƣu huỳnh, streptomycin và methicillin bằng phƣơng pháp

khuếch tán trên đĩ a thạch, nhƣ̃ng khác biệt này cũng có thể là do sƣ̣ khác biệt về

nguồn phân lập vi khuẩn.

E. tarda có thể gây ra sự bùng phát bệnh xuất huyết trong ao nuôi cá chình

hay bệnh thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm trùng cơ hội ở ngƣời [22]. Các

báo cáo này cho thấy E. tarda gây ra bùng phát ổ dịch trong hàng loạt các ao nuôi.

E. tarda thƣờng đƣợc phân lập từ cá hồi và các loài cá khác ở Tây bắc Thái Bình

Dƣơng của Hoa Kỳ và cũng đƣợc khẳng định là nguyên nhân gây bệnh trên cá hồi,

cá bẹ và cá hồi cầu vồng cũng nhƣ là cá da trơn [12].

Theo báo cáo của Grimont và cộng sự năm 1980, môi trƣờng sống của E.

hoshinae đƣợc biết đến hiện nay bao gồm các loài bò sát, chim và nƣớc. Mặt dù có

hai trong số các nghiên cứu của họ đƣợc phân lập từ phân con ngƣời nhƣng những

ngƣời này không bị bệnh nên không có bằng chứng để khẳng định E. hoshinae gây

ra bệnh tiêu chảy cho ngƣời. Một loài khác của Edwardsiella là E. ictaluri đƣợc cho

là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết cấp tính trên cá da trơn. Từ khi công bố đầu

tiên của Hawke và đtg (1981), bệnh này đã trở thành một vấn đề rất trầm trọng của

ngành nuôi cá da trơn trong vùng đông nam Hoa Kỳ. Shott và đtg (1986) cho rằng

bệnh sinh của E. ictaluri có thể đƣợc truyền thông qua nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa.

Viêm ruột gây nhiễm trùng máu do E. ictaluri gây ra khi nhiệt độ môi trƣờng từ 22-

28oC, và tiến triển nhanh chóng, kết quả là tỷ lệ tử vong tăng lên đáng kể [18].

Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của E. ictaluri trong phòng thí nghiệm là từ

25 - 30oC và nhiệt độ cho bệnh bắt đầu xuất hiện ở ngoài môi trƣờng là khoảng 22 -