phân lập và tuyển chọn một số dòng aspergillus niger sinh pectin methylesterase hoạt tính cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRẦN THANH TRÖC

MSHV: 62030803

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

MỘT SỐ DÕNG ASPERGILLUS NIGER SINH

PECTIN METHYLESTERASE HOẠT TÍNH CAO

LUẬN ÁN TI N S SINH HỌC

Cần Thơ, năm 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRẦN THANH TRÖC

MSHV: 62030803

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN

MỘT SỐ DÕNG ASPERGILLUS NIGER SINH

PECTIN METHYLESTERASE HOẠT TÍNH CAO

LUẬN ÁN TI N S SINH HỌC

Chu n ng nh: VI SINH VẬT HỌC

Mã ngành: 62 42 01 07

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS TS NGUYỄN V N MƢỜI

TS NGUYỄN V N THÀNH

Cần Thơ, năm 2013

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h i i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của NCS Trần Thanh Trúc với sự

hƣớng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời và TS. Nguyễn Văn Thành. Các số liệu

và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chƣa từng đƣợc công bố riêng lẻ

bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trƣớc đây.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

PGS. TS. NGUYỄN V N MƢỜI

TS. NGUYỄN V N THÀNH

Tác giả luận văn

TRẦN THANH TRÖC

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h ii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

LỜI CẢM ƠN

Hơn cả sự biết ơn, tôi cảm thấy thật hạnh phúc và may mắn khi đƣợc thực hiện luận án tiến

sĩ dƣới sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời và TS. Nguyễn Văn Thành.

Lời cảm ơn đầu tiên, tôi xin đƣợc gởi đến PGS. TS. Nguyễn Văn Mƣời – giáo viên hƣớng

dẫn chính. Thật sự vinh dự và tự hào khi tôi đƣợc là học trò của Thầy. Thầy chính là ngƣời

truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy ở tôi sự nỗ

lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trƣớc những khó khăn trong suốt tiến

trình thực hiện luận án tiến sĩ. Xin cám ơn Thầy đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn

giúp em có đƣợc định hƣớng đúng đắn trong công việc.

Tôi cũng xin gởi lời tri ân đến TS. Nguyễn Văn Thành – Thầy luôn đóng góp cho tôi rất

nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngại thời gian cùng tôi nghiên cứu những vấn đề mới

phát sinh để có kết quả thu nhận tốt nhất.

Tôi đặc biệt biết ơn sự giúp đỡ và hỗ trợ và cả động viên của TS. Trần Nhân Dũng – Giám

đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã giúp tôi có thể hoàn tất tốt nội

dung nghiên cứu.

Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn đƣợc sự đồng

hành, hỗ trợ của các em học viên cao học ngành Công nghệ sinh học, Công nghệ thực

phẩm, sinh viên đại học từ các khóa 28 đến khóa 35. Các em không quản ngại khó khăn,

thời gian để cùng với tôi thực hiện các nghiên cứu và hơn thế nữa, các em còn luôn tiếp

sức và hỗ trợ tôi trong nhiều lĩnh vực và trong cuộc sống,... đến tận thời điểm này.

Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Cần Thơ,

Phòng Tổ chức Cán bộ, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Đào tạo, Khoa Sau đại học và các

phòng ban chức năng khác của Trƣờng; đặc biệt là Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng

dụng, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho

việc thực hiện đề tài nghiên cứu. Xin cám ơn Thầy Cô ở Bộ môn Công nghệ Thực phẩm,

Trƣờng Đại học Cần Thơ – nơi tôi đang công tác đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho

nghiên cứu này.

Tôi cũng xin đƣợc gởi lời cám ơn đến GS. TS. Lƣu Duẫn, PGS. TS. Đống Thị Anh Đào và

nhiều bạn bè gần xa đã luôn động viên và giúp tôi có thêm nỗ lực phấn đấu, hoàn thành

nghiên cứu.

Xin cám ơn quý Thầy Cô trong Hội đồng chấm Luận án Tiến sĩ cấp cơ sở đã có nhiều góp

ý và đƣa ra nhiều lời khuyên bổ ích, giúp tôi hoàn thiện luận án tốt hơn.

Đặc biệt, xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến hai phản biện độc lập với những góp ý cụ thể,

những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn tất tốt hơn nữa các nội dung nghiên cứu của luận án.

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h iii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

Cám ơn các Thầy Cô giáo cũ đã không ngừng động viên, khuyến khích, các bạn bè gần xa

đã luôn khích lệ tôi trong suốt tiến trình học tập.

Cuối cùng, tôi xin đƣợc gởi lời biết ơn đến gia đình với tất cả tình yêu và sự khuyến khích,

ủng hộ đã dành cho tôi trong chặng đƣờng cam go để hoàn thành đƣợc luận án nghiên cứu

này. Đặc biệt, xin dành tặng ba mẹ các thành quả mà hôm nay con đã đạt đƣợc.

Chân thành cám ơn.

Cần Thơ, ngày tháng 03 năm 2013

Nghiên cứu sinh thực hiện

Trần Thanh Trúc

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h iv i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

TÓM LƢỢC

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng Aspergillus niger sinh pectin methylesterase

hoạt tính cao” đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa

Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có

liên quan, từ tháng 11.2008 đến tháng 9.2012.

Đề tài đƣợc thực hiện với mục tiêu nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp và ứng dụng

enzyme pectin methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) từ sự lên men bề mặt trên môi trƣờng

rắn, sử dụng dòng Aspergillus niger (A. niger) đặc hiệu đƣợc phân lập và tuyển chọn trong

điều kiện thực tế tại Việt Nam.

Kết quả nghiên cứu đã phân lập đƣợc 60 dòng có đặc tính giống Aspergillus niger từ vỏ

các loại quả giàu pectin phổ biến ở khu vực đồng b ng sông Cửu Long nhƣ vỏ cam, bƣởi,

chanh, hạnh, táo và sung, sử dụng các môi trƣờng nƣớc trích khoai tây (Potato Dextrose

Agar, PDA), Czapek Dox Agar (CZ) và Malt Extract Agar (MEA). Việc tuyển chọn các

dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp pectinase đƣợc thực hiện b ng cách đo đƣờng

kính vòng phân giải pectin cho thấy, tất cả 60 dòng đều có khả năng phân giải pectin, trong

đó 14 dòng nấm đã phân lập có đƣờng kính vòng phân giải lớn hơn 20 mm.

Kết quả sàng lọc các dòng nấm có khả năng sinh tổng hợp PME từ 14 dòng đặc hiệu với

pectinase đã tuyển chọn đƣợc 4 dòng có hoạt tính PME thu đƣợc cao và ổn định, ký hiệu

T1, N1, So2 và R1 phân lập từ vỏ táo ta, vỏ quả chanh núm, vỏ cam soàn và bƣởi Năm Roi.

Sự kết hợp của 2 dòng R1 và So2 với tỷ lệ 1:1 đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu xác định

điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rắn sinh tổng hợp PME có hiệu quả cao nhất. Kỹ

thuật giải trình tự gene 28S rRNA cũng đƣợc áp dụng để nhận diện bốn (4) dòng T1, N1,

So2 và R1, kết quả cho thấy, 4 dòng này đều thuộc A. niger với mức độ đồng hình 99 ÷

100%.

Điều kiện lên men rắn sinh tổng hợp PME từ tổ hợp A. niger So2 và R1 đã đƣợc xác định

dựa trên việc khảo sát một số yếu tố đơn lẻ (thành phần cơ chất, dinh dƣỡng, tác động của

dung dịch đệm và thời gian ủ) kết hợp với việc tối ƣu hóa một số yếu tố chính (pH ban đầu,

độ ẩm môi trƣờng lên men, tỷ lệ bào tử nấm mốc sử dụng và nhiệt độ lên men) theo

phƣơng pháp bề mặt đáp ứng với mô hình phức hợp tại tâm. Điều kiện ly trích, thu nhận

enzyme sau lên men (pH của dung dịch đệm, tỷ lệ dung môi và cơ chất, nhiệt độ và thời

gian ly trích tƣơng ứng) cũng đƣợc xác định. Kết quả đã cho thấy hiệu quả của việc tận

dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp là bã táo ta khô và vỏ bƣởi Năm Roi tƣơi làm cơ chất

lên men chính (với tỷ lệ bã táo ta và vỏ bƣởi là 1:1 w/w) cho việc thu nhận PME. Quá trình

lên men đạt hiệu quả cao nhất khi môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh đến độ ẩm 57,4%

b ng dung dịch đệm citrate pH 4,0, có bổ sung 0,1% urea, 0,5% MgCl2 và 0,15% CaCl2, tỷ

lệ huyền phù bào tử nấm ở mật số 105

cfu/mL sử dụng là 16,5% v/w (mL/g). Sau 96 giờ ủ

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h v i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

ở nhiệt độ 35,5°C, PME thô đƣợc ly trích ở nhiệt độ 35°C trong thời gian 50 phút b ng

dung dịch đệm citrate pH 3,6, sử dụng tỷ lệ dung dịch đệm và cơ chất là 2:1 v/w (mL/g).

Ƣớc tính hoạt tính PME đạt đƣợc ở điều kiện lên men và ly trích tốt nhất là 79,1 U/g cơ

chất.

PME thô thu đƣợc sau khi tinh sạch sơ bộ b ng kết tủa với ethanol ở tỷ lệ 3:1 (v/v), thể

hiện ở hoạt tính riêng là 10,02 U/mgprotein, hiệu suất thu hồi 91,48% và độ tinh sạch tăng

gấp 7,98 lần so với mẫu enzyme thô. Sau khi kết tủa với ethanol, tiến hành lọc màng ở

khoảng phân đoạn 50 kDa thu đƣợc PME có hoạt tính riêng đạt 15,63 U/mgprotein, độ tinh

sạch tăng 12,40 ± 0,89 lần khi so sánh với mẫu enzyme thô. PME từ A. niger có khối

lƣợng phân tử khoảng 43 kDa, h ng số Km của PME đạt đƣợc là 0,6014 mg/mL. Hoạt tính

của PME thu nhận từ A. niger thể hiện cao nhất ở 38 ÷ 40°C và pH môi trƣờng 5,0. Cả hai

muối CaCl2 và NaCl đều có tác dụng hoạt hóa, làm tăng hoạt tính của PME từ A. niger.

Đồng thời, sự bất hoạt nhiệt của PME tuân theo phƣơng trình bậc 1 chuyển đổi một phần

với hệ số góc k tăng dần khi nhiệt độ tăng từ 50 đến 70°C.

Việc nghiên cứu thử nghiệm trên một vài sản phẩm thực phẩm có cấu trúc không ổn định

cũng đã khẳng định hiệu quả tích cực của chế phẩm PME kỹ thuật từ nấm mốc trong việc

cải thiện độ cứng chắc của sản phẩm sau chế biến, điển hình là khóm lạnh đông và dƣa leo

muối chua.

Từ khóa: Aspergillus niger, cải thiện cấu trúc, cơ chất giàu pectin, hoạt tính cao, lên

men bề mặt cơ chất rắn, pectin methylesterase, phân lập, tuyển chọn.

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h vi i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

SUMMARY

The thesis “Isolation and screening of Aspergillus niger biosynthesize high activity pectin

methylesterase” was performed in the laboratory of Food Technology Department, College

of Agriculture and Applied Biology, Can Tho University and other laboratories, from

11.2008 to 9.2012.

The thesis was conducted to investigate the biosynthesis process and application of pectin

methylesterase (PME, EC 3.1.1.11) in solid state fermentation (SSF) of isolated and

selected Aspergillus niger from the practical conditions of Vietnam.

Sixty species which have morphologically similar Aspergillus niger were isolated from the

peels of rich pectin fruits which have been found to be widely in Mekong delta, such as

orange, pomelo, citrus, apple and fig peels on Potato Dextrose Agar (PDA), Czapek Dox

Agar (CZ) and Malt Extract Agar (MEA). To indicate the pectinase activity of the

organisms, diameters of clear zone around colonies on pectin - agar medium were

measured. The result showed that all of sixty isolates have the ability of pectinolytic

activities, in which 14 out of the 60 isolates were able to produce a higher pectinase

activity, based on the average clear zone diameters were larger than 20 mm.

Further screening of PME production of the 14 selected isolates, the maximum PME

production was obtained by 4 isolates (T1, N1, So2 and R1) which were isolated from the

peels of Ziziphus mauritiana (“tao ta”), Citrus lemon (“chanh num”), Citrus sinensis L.

(“cam soan”) and Citrus maxima (“Nam Roi” pomelo), respectively. The combination of

two isolates of R1 and So2 with the proportion of 1:1, was conducted to investigate the

suitable conditions for PME biosynthesis by solid state fermentation. In addition, the

identification by sequencing of 28S rRNA gene, revealed that 4 selected isolates T1, N1,

So2 and R1 had 99 ÷ 100% identity to Aspergillus niger.

The optimal conditions of pectin methylesterase biosynthesis from A. niger So2 and

R1 in solid-state fermentation were evaluated, based on the individual factors (substrate

characteristics, nutrients, buffer solutions and incubation time) which influenced to PME

production were investigated. After that, the Response surface methodology (RSM) based

on four-variable central composite design (CCD) can be used to model the correlation of

the fermentation conditions such as inducer concentration, initial pH, incubation

temperature and moisture content of medium to PME activity. Moreover, some extraction

parameters consist of type of solvent, pH, ratio of solvent and fermented solids were

studied. In addition, the best combination of extraction temperature, contact time was also

determined.

Especially, the use of rich pectin of agricultural material in Mekong Delta (mixture of

apple pomace and pomelo peels at the ratio of 1:1 w/w) as a fermentation medium was

taken into consideration for the PME production of A. niger in this investigation. With the

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h vii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

addition of 0.1% urea combined with 0.5% MgCl2 and 0.15% CaCl2 into media, the

highest PME obtained after 96 hours incubation at a temperature of 35.5°C, pH 4.0

(adjusted by citrate buffer), fermentation temperature and moisture content adjusted

to 57.4% and 16.5% v/w of inducer concentration (105

cfu/mL). In addition, citrate buffer

(pH 3.6) at 35°C and 50 min provided the best recovery in order to obtain highest value

of PME. The ratio 2:1 (v/w) of solvent and substrate was determined as an optimal

condition for concentrated enzyme extracts. Maximum production of PME (about 79.1 U/g

of substrate) was recorded under optimum conditions of SSF and extraction.

Ethanol was the appropriate precipitant for PME purification with the optimal ratio of cold

ethanol and crude enzyme 3: 1 (v/v). In this case, specific activity of PME was 10.02

U/mgprotein, the purification factor achieved 7.98 fold and the PME recovery yield obtained

91.48%. Combined with the cross flow membrane step, the specific activity of PME

reached to 15.63 U/mgprotein and the purification factor achieved 12.40 ± 0.89 fold in

comparison to the crude enzyme solution. The molecular weight of the enzyme was found

to be 43 kDa and Km was 0.6014 g/L. The activity of the enzyme was stimulated by NaCl

or CaCl2. In addition, the optimum temperature and pH of A. niger PME

were 38 ÷ 40°C and 5.0, respectively. Isothermal inactivation of partial purified

A. niger PME could be described by a fractional – conversion model and the inactivation

rate constants increase with increasing temperatures from 50 to 70°C.

The obtained technical PME enzyme also proved the positive effects to improving of the

texture of frozen pineapples and fermented cucumbers.

Key words: Aspergillus niger, isolation, high activity, pectin methylesterase, rich pectin

substrate, screening, solid state fermentation, texture improvement.

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h viii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN..................................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................ii

TÓM LƢỢC........................................................................................................................iv

SUMMARY .........................................................................................................................vi

MỤC LỤC .........................................................................................................................viii

DANH SÁCH BẢNG........................................................................................................xiii

DANH SÁCH HÌNH.......................................................................................................... xv

TỪ VI T TẮT...................................................................................................................xix

THUẬT NGỮ..................................................................................................................... xx

MỞ ĐẦU............................................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của đề t i......................................................................................... 1

2. Mục ti u v nội dung nghi n cứu .......................................................................... 2

3. Đối tƣợng v phạm vi nghi n cứu ......................................................................... 3

4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học v thực tiễn của luận án ..................... 3

5. Cách tiếp cận v giả thu ết khoa học.................................................................... 4

6. Kết cấu của luận án ................................................................................................ 5

Chƣơng 1 T NG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................. 6

1.1 Tổng quan về enz me pectin meth lesterase...................................................... 6

1.1.1 Tổng quan............................................................................................................ 6

1.1.2 Tính chất sinh lý của PME .................................................................................. 6

1.1.3 Kiểu phản ứng của PME...................................................................................... 7

1.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến động học của enzyme PME ...................................... 8

1.2 Tầm quan trọng của việc sử dụng PME trong thực tiễn ................................. 10

1.2.1 Các ứng dụng cơ bản ......................................................................................... 10

1.2.2 Tổng quan về công nghệ chế biến rau quả và sự biến đổi đặc tính cấu trúc của

rau quả trong quá trình chế biến .......................................................................................... 12

1.2.3 Vai trò của pectin và PME đối với sự cải thiện đặc tính cấu trúc của thực phẩm

nguồn gốc thực vật............................................................................................................... 13

1.3 Vai trò của việc thu nhận PME từ nấm mốc Aspergillus niger đặc hiệu........ 19

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h ix i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

1.3.1 Tầm quan trọng của việc thu nhận PME từ nấm mốc A. niger ......................... 19

1.3.2 Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc sinh tổng hợp

enzyme PME........................................................................................................................ 20

1.3.3 Nguồn nguyên liệu cho quá trình phân lập và tuyển chọn A. niger sinh tổng hợp

PME hoạt tính cao................................................................................................................ 21

1.4 Tổng quan về nấm Aspergillus niger ................................................................. 22

1.4.1 Giới thiệu chung ................................................................................................ 22

1.4.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger...................................................... 23

1.4.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản ................................................................................... 23

1.4.4 Chuyên luận phân loại Aspergillus niger .......................................................... 24

1.4.5 Định danh Aspergillus niger theo phƣơng pháp truyền thống .......................... 24

1.4.6 Định danh nhóm loài Aspergillus b ng phƣơng pháp sinh học phân tử............ 25

1.5 Phƣơng pháp tu ển chọn dòng nấm mốc Aspergillus niger có khả năng sinh

tổng hợp PME .................................................................................................................... 26

1.5.1 Lý thuyết chung................................................................................................. 26

1.5.2 Tuyển chọn dòng Aspergillus niger sinh tổng hợp PME theo phƣơng pháp sàng

lọc tự nhiên .......................................................................................................................... 27

1.6 Ảnh hƣởng của th nh phần môi trƣờng đến quá trình sinh tổng hợp PME. 27

1.6.1 Vai trò của cơ chất trong quá trình lên men sinh tổng hợp PME ...................... 27

1.6.2 Ảnh hƣởng của thành phần đa lƣợng................................................................. 29

1.6.3 Ảnh hƣởng của nguồn khoáng dinh dƣỡng ....................................................... 30

1.7 Tác động của phƣơng thức v điều kiện l n men đến hiệu quả sinh tổng hợp

PME ............................................................................................................................... 30

1.7.1 Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy...................................................................... 30

1.7.2 Độ ẩm môi trƣờng ............................................................................................. 30

1.7.3 Điều kiện pH ban đầu của môi trƣờng............................................................... 31

1.7.4 Ảnh hƣởng của thời gian ủ ................................................................................ 32

1.7.5 Ảnh hƣởng của phƣơng thức lên men đến quá trình tổng hợp PME................. 33

1.8 Các ếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả thu nhận PME từ canh trƣờng bề mặt 34

1.9 Các biện pháp tinh sạch PME kỹ thuật ............................................................ 35

1.9.1 Tầm quan trọng của chế phẩm enzyme kỹ thuật trong công nghệ thực phẩm .. 36

1.9.2 Tinh sạch sơ bộ PME b ng phƣơng pháp kết tủa .............................................. 37

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h x i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

1.9.3 Ứng dụng kỹ thuật lọc màng trong tinh sạch enzyme kỹ thuật ......................... 38

1.10 Qu hoạch thực nghiệm xác định điều kiện l n men thích hợp bằng

phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) .............................................................................. 38

1.11 Tình hình nghi n cứu trong v ngo i nƣớc về lĩnh vực phân lập, tu ển

chọn v sinh tổng hợp PME.............................................................................................. 39

Chƣơng 2 PHƢƠNG TIỆN & PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 45

2.1 Phƣơng tiện nghi n cứu...................................................................................... 45

2.1.1 Địa điểm, thời gian ............................................................................................ 45

2.1.2 Thiết bị, hoá chất ............................................................................................... 45

2.2 Phƣơng pháp nghi n cứu.................................................................................... 47

2.2.1 Chuẩn bị mẫu..................................................................................................... 47

2.2.2 Phƣơng pháp phân tích và đo đạc...................................................................... 48

2.2.3 Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................ 50

2.3 Nội dung nghi n cứu ........................................................................................... 52

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát............................................................................... 52

2.3.2 Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn dòng nấm mốc A. niger đặc hiệu cho quá

trình sinh tổng hợp PME...................................................................................................... 54

2.3.3 Nội dung 2: Xác định các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men rắn sinh tổng

hợp PME ........................................................................................................................... 60

2.3.4 Nội dung 3: Tinh sạch sơ bộ và xác định đặc điểm của PME từ A. niger......... 71

2.3.5 Nội dung 4: Ứng dụng chế phẩm PME từ A. niger trong cải thiện đặc tính cấu

trúc rau quả .......................................................................................................................... 77

Chƣơng 3 K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 81

3.1 Phân lập v xác định đặc điểm hình thái các dòng nấm có đặc tính giống A.

niger từ vỏ các loại quả gi u pectin.................................................................................. 81

3.1.1 Kết quả phân lập các dòng nấm đen thuộc nhóm Aspergillus từ vỏ các loại quả

giàu pectin ........................................................................................................................... 81

3.1.2 Định loại các dòng vừa phân lập dựa trên đặc điểm đại thể của khuẩn lạc....... 83

3.1.3 Đặc điểm của bào tử đính và bộ máy mang bào tử của các dòng nấm mốc phân

lập ........................................................................................................................... 85

3.2 Tu ển chọn dòng nấm mốc đặc hiệu đối với PME........................................... 88

3.2.1 Đánh giá khả năng sinh pectinase của các dòng nấm đã đƣợc phân lập ........... 88

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h xi i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

3.2.2 Tuyển chọn dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao ..... 92

3.2.3 Khả năng kết hợp các dòng nấm mốc đặc hiệu đến hiệu quả thu nhận PME.... 94

3.2.4 Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng So2 và R1 đặc hiệu theo các tỷ lệ khác

nhau đến hiệu quả sinh tổng hợp PME hoạt tính cao .......................................................... 96

3.3 Bƣớc đầu định danh một số dòng A. niger đã phân lập bằng kỹ thuật sinh

học phân tử......................................................................................................................... 98

3.4 Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến quá trình sinh tổng hợp PME từ

2 dòng A. niger R1 và So2 ................................................................................................. 100

3.4.1 Xác định thành phần cơ bản của cơ chất lên men ........................................... 100

3.4.2 Đánh giá tác động của thành phần cơ chất đến hoạt tính PME thu nhận từ quá

trình lên men SSF của hai dòng nấm mốc A. niger R1 và So2 ........................................... 102

3.4.3 Vai trò của việc bổ sung khoáng đến khả năng tổng hợp PME từ A. niger .... 104

3.4.4 Tác động của nguồn nitrogen bổ sung đến hiệu quả thu nhận PME từ quá trình

lên men SSF dòng A. niger So2 và R1................................................................................ 107

3.5 Tác động của một số điều kiện l n men đến hiệu quả thu nhận PME từ

A. niger trong quá trình nuôi cấ SSF ........................................................................... 109

3.5.1 Ảnh hƣởng của loại dung dịch đệm sử dụng trong điều chỉnh độ ẩm và pH ban

đầu của môi trƣờng lên men đến hiệu quả sinh tổng hợp PME......................................... 109

3.5.2 Sự thay đổi hoạt tính PME và thành phần cơ chất của môi trƣờng nuôi cấy theo

thời gian ủ ......................................................................................................................... 111

3.5.3 Sự tƣơng tác giữa pH, độ ẩm ban đầu của môi trƣờng, tỷ lệ huyền phù bào tử

nấm và nhiệt độ ủ đến quá trình sinh tổng hợp PME từ A. niger ...................................... 113

3.6 Ảnh hƣởng của điều kiện l trích đến hiệu quả thu nhận PME sau quá trình

lên men SSF...................................................................................................................... 120

3.6.1 Ảnh hƣởng của việc thay đổi giá trị pH dung dịch đệm đến hiệu quả ly trích

PME ......................................................................................................................... 120

3.6.2 Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung dịch ly trích và canh trƣờng bề mặt sau khi lên men

đến hiệu quả ly trích PME từ nấm mốc A. niger ............................................................... 122

3.6.3 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả ly trích PME ................... 124

3.6.4 Ảnh hƣởng của nhiệt độ bảo quản đến độ ổn định của dịch trích PME thô.... 126

3.7 Tinh sạch v xác định đặc điểm của PME đƣợc sinh tổng hợp từ tổ hợp

A. niger So2 và R1 ............................................................................................................ 129

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h xii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

3.7.1 Ảnh hƣởng của loại hóa chất và tỷ lệ sử dụng đến khả năng kết tủa PME từ

A. niger ......................................................................................................................... 129

3.7.2 Tinh sạch sơ bộ PME từ A. niger b ng phƣơng pháp lọc màng...................... 135

3.7.3 Một số đặc điểm cơ bản của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger ... 137

3.8 Khả năng ứng dụng của chế phẩm PME kỹ thuật thu nhận từ A. niger So2

và R1 đến khả năng cải thiện cấu trúc rau quả ............................................................. 146

3.8.1 Đối với sản phẩm khóm lạnh đông.................................................................. 146

3.8.2 Tác động của PME đến sự cải thiện cấu trúc dƣa leo muối chua.................... 151

K T LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................................................. 155

1. Kết luận................................................................................................................ 155

2. Đề nghị ................................................................................................................. 156

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 157

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ...................................................... 177

PHỤ LỤC 1 MÔI TRƢỜNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NHẬN DIỆN NẤM MỐC, CÁC

PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH.......................................................................................xxi

PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ K T QUẢ KHẢO SÁT .............................................................xli

PHỤ LỤC 3 K T QUẢ THỐNG KÊ............................................................................lxiii

PHỤ LỤC 4 MỘT SỐ HÌNH ẢNH ............................................................................ cxv

Lu n n t t nghi p iến sĩ Kh 2008 - 2012 rường ĐH Cần hơ

Chuyên ngành Vi sinh v t h xiii i n Nghi n ứu v Ph t tri n C ng ngh inh h

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần pectin và mức độ ester hóa của pectin ở một số loại trái cây..........21

Bảng 1.2: Các chất dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, nguồn gốc và chức năng đối với tế bào

nấm mốc Aspergillus sp.......................................................................................................28

Bảng 2.1: Các chỉ tiêu, phƣơng pháp phân tích và đo đạc...................................................49

Bảng 2.2: Công thức tính toán, đánh giá hiệu quả tinh sạch PME ......................................50

Bảng 2.3: Giá trị mã hóa và giá trị thực của các nhân tố tƣơng tác đến hiệu quả sinh tổng

hợp PME (U/g) ....................................................................................................................66

Bảng 2.4: Các nghiệm thức khảo sát theo phƣơng pháp bề mặt đáp ứng, áp dụng thiết kế

trung tâm phức hợp..............................................................................................................67

Bảng 3.1: Số dòng nấm mốc đƣợc phân lập từ vỏ các loại quả giàu pectin .......................82

Bảng 3.2: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme pectinase .............................89

Bảng 3.3: Kết quả thống kê sự khác biệt đƣờng kính vòng phân giải pectin (D) của các

dòng nấm mốc thuộc nhóm đặc hiệu cao với pectinase.......................................................90

Bảng 3.4: Sự thay đổi đƣờng kính vòng phân giải pectin và hoạt tính PME sinh tổng hợp từ

các dòng nấm mốc đặc hiệu với pectinase...........................................................................93

Bảng 3.5: Đánh giá khả năng kết hợp hai dòng nấm mốc đến hiệu quả thu nhận enzyme

PME .....................................................................................................................................95

Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của tỷ lệ kết hợp hai dòng R1 và So2 đến hiệu quả sinh tổng hợp

PME hoạt tính cao................................................................................................................97

Bảng 3.7: Thành phần hóa học cơ bản của các nguồn cơ chất lên men ............................101

Bảng 3.8: Sự thay đổi hoạt tính PME ở các tỷ lệ kết hợp khác nhau của bã táo ta và vỏ quả

cam/bƣởi ............................................................................................................................102

Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của nồng độ và loại khoáng bổ sung vào môi trƣờng lên men đến sự

thay đổi hoạt tính của PME từ A. niger .............................................................................105

Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của việc bổ sung kết hợp các loại khoáng vào môi trƣờng nuôi cấy

đến khả năng sinh tổng hợp PME từ A. niger....................................................................107

Bảng 3.11: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng và nguồn nitrogen bổ sung đến hoạt tính PME từ

quá trình sinh tổng hợp A. niger ........................................................................................108

Bảng 3.12: Sự thay đổi hàm lƣợng pectin, DE, độ ẩm của canh trƣờng sau khi lên men và

pH của dịch trích enzyme sau thời gian nuôi cấy ..............................................................112

Bảng 3.13: Ảnh hƣởng của các nhân tố mã hóa đối với phƣơng trình hồi quy .................114

Bảng 3.14: Ảnh hƣởng của tỷ lệ dung dịch đệm citrate và canh trƣờng sau lên men đến

hiệu quả thu nhận PME......................................................................................................122

Bảng 3.15: Hiệu quả tinh sạch PME b ng phƣơng pháp kết tủa với (NH4)2SO4 ..............130