Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào và đối kháng vi sinh vật :Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

TÊN ĐỀ TÀI

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN

CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME NGOẠI BÀO

VÀ ĐỐI KHÁNG VI SINH VẬT

Mã số đề tài: 19.2TP04SV

Chủ nhiệm đề tài: Đặng Bích Ngân

Hứa Trường Chinh

Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học và Thực Phẩm

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2020

1

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme

ngoại bào và đối kháng vi sinh vật” là nội dung chúng em chọn để thực hiện đề tài nghiên

cứu cấp trường của mình. Để thực hiện tốt đề tài nghiên cứu này, chúng em xin gửi lời cảm

ơn chân thành đến Ban giám hiệu, phòng Quản lí Khoa học và Hợp tác Quốc tế trường Đại

học Công nghiệp TP.HCM đã tạo một môi trường học tập và nghiên cứu thân thiện cũng

như những hỗ trợ về mặt kinh phí để cho chúng em phát huy khả năng nghiên cứu khoa học

của mình.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở trang thiết bị cho chúng em trong

quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh. Cảm ơn cô vì đã chỉ

bảo, hướng dẫn em tận tình, cung cấp cho chúng em những kiến thức sâu rộng trong suốt

quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Phạm Tấn Việt, TS. Nguyễn Ngọc Ẩn đã

luôn cho em những lời khuyên, lời góp ý hữu ích, giúp cho chúng em tích lũy thêm nhiều

kiến thức, có cái nhìn sâu sắc hơn về các vấn đề trong nghiên cứu cũng như trong cuộc sống,

giúp chúng em hoàn thành tốt nghiên cứu của mình.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn ba mẹ vì đã luôn yêu thương, quan tâm chăm sóc và tạo động

lực tiếp bước cho con trên đường học vấn.

Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, bạn bè trong tập thể Lab vi sinh đã ủng hộ,

giúp đỡ chúng em trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu này.

Mặc dù đã cố gắng hoàn thành nghiên cứu trong phạm vi cho phép nhưng khả năng và kinh

nghiệm của bản thân có hạn, nên bài nghiên cứu chắc chắn sẽ không tránh khỏi những tồn

tại, hạn chế và thiếu sót. Chúng em rất mong nhận được sự thông cảm, góp ý và tận tình chỉ

bảo của quý thầy cô và các bạn.

2

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG

I. Thông tin tổng quát

1.1. Tên đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp enzyme ngoại bào và đối kháng vi sinh vật.

1.2. Mã số: 19.2TP04SV

1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT

Họ và tên

(học hàm, học vị)

Đơn vị công tác

Vai trò thực hiện

đề tài

1 TS. Nguyễn Thị Diệu Hạnh Viện Công nghệ Sinh học và

Thực phẩm Cố vấn khoa học

2 Hứa Trường Chinh

ĐHSH12A, Viện Công nghệ

Sinh học và Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài

3 Đặng Bích Ngân

ĐHSH12A, Viện Công nghệ

Sinh học và Thực phẩm Chủ nhiệm đề tài

1.4. Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học & Thực phẩm

1.5. Thời gian thực hiện:

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 3 năm 2020

1.5.2. Gia hạn (nếu có): 6 tháng

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 9 năm 2020

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Không có

1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 05 triệu đồng (số tiền bằng chữ: Năm

triệu đồng).

3

II. Kết quả nghiên cứu

1. Đặt vấn đề

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn gram dương, hiếu khí, sống hoại sinh, thường có tỷ lệ GC trong

DNA cao hơn 55%. Trong chu trình sống, chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi không

có vách ngăn. Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước và các cơ chất hữu

cơ. Chúng được xem là sinh vật trung gian giữa nấm và vi khuẩn do vừa có đặc điểm giống

nấm, vừa giống vi khuẩn. Chúng có vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất

của tự nhiên, tạo độ phì nhiêu cho đất và đảm nhận nhiều chức năng trong việc làm màu

mỡ thêm cho đất, tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất

hữu cơ phức tạp như là cellulose, tinh bột, lignin,… do chúng có khả năng sinh tổng hợp

nhiều loại enzyme ngoại bào như amylase, cellulase,… được ứng dụng rộng rãi trong xử lí

các chất thải công nghiệp có chứa hàm lượng tinh bột hay cellulose cao [1], [2].

Xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng, đặc biệt là

các hợp chất kháng sinh. Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn có phổ kháng khá

rộng nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống như nông nghiệp, công

nghiệp thực phẩm, y tế,... Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn có khả năng sinh ra các

hợp chất hữu cơ như các vitamin nhóm B (B1, B2, B6), một số acid hữu cơ như acid lactic,

acid acetic và nhiều acid amin như glutamic, methionin,… Một số khác còn có khả năng

tạo thành những chất kích thích sinh trưởng của thực vật [3], [4].

Hiện tượng kháng kháng sinh và sự gia tăng các loại bệnh là mối quan tâm lớn của cộng

đồng. Việc nghiên cứu lựa chọn các tác nhân mới từ tự nhiên có khả năng đối kháng với

mầm bệnh được ưu tiên hàng đầu, trong đó xạ khuẩn là vi sinh vật tiềm năng. Xạ khuẩn là

loài sinh vật có tính đa dạng cao, có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào

và các hợp chất chuyển hóa thứ cấp đa dạng có khả năng đối kháng với nhiều mầm bệnh

khác nhau. Hiện nay, việc sử dụng các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn được ứng

dụng rộng rãi trong việc kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, kháng virus... [5], [6].

Do đó, đề tài nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng

hợp enzyme ngoại bào và đối kháng visinh vật” được thực hiện với mục đích làm cơ sở đáp ứng

nhu cầu cuộc sống hiện nay.

4

2. Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học cao (khả năng sinh

tổng hợp enzyme ngoại bào, kháng khuẩn, kháng mốc).

3. Nội dung nghiên cứu

- Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các nguồn khác nhau.

- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hệ enzyme ngoại bào mạnh: amylase, cellulase,

protease.

- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn đối kháng với vi khuẩn và nấm mốc gây bệnh.

4. Phương pháp nghiên cứu

4.1. Phương pháp lấy mẫu

Chọn điểm thu mẫu đất: các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác nhau (đất gò cao, khu

vực có nhiều gỗ cây bị hoai mục, đất khu vực ẩm ướt, bờ ruộng, khu vực xung quanh chuồng

gà, chuồng lợn,…) thuộc 2 tỉnh Bến Tre và Long An.

Cách lấy mẫu: dùng dao lấy khoảng 10-15g đất ở độ sâu 10-15 cm ở các vị trí trên, cho

vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín, ghi ngày và vị trí lấy mẫu. Mẫu đất được bảo quản ở

4

°C, sau 2 ngày tiến hành phân lập xạ khuẩn [7], [8].

4.2. Phân lập xạ khuẩn từ đất

Các mẫu đất được pha loãng thập phân đến nồng độ thích hợp (10-2

, 10-3

...10-6

) bằng nước

cất hoặc nước muối sinh lí vô trùng. Từ mỗi nồng độ pha loãng, hút 100µl dịch mẫu đã pha

loãng chuyển sang đĩa Petri chứa môi trường Gause I. Dùng que trang trải đều và ủ ở nhiệt

độ phòng trong 7 ngày. Tiến hành nhận diện khuẩn lạc đặc trưng của xạ khuẩn.

Từ các khuẩn lạc đã nhận diện, tiến hành làm thuần chúng bằng cách cấy ria trên môi trường

Gause I, đến khi nhận được các khuẩn lạc thuần khiết. Bảo quản giống 4°C và giữ giống

trong glycerol 40% ở -60°C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo [9], [10].

4.3. Quan sát đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Quan sát đại thể: Xạ khuẩn được cấy ria trên môi trường Gause I ở nhiệt độ phòng, quan sát

các đặc điểm về đại thể sau 4 ngày cấy: kích thước, hình dạng, đặc điểm của bề mặt, rìa, màu

5

sắc khuẩn lạc mặt trên, mặt dưới, sắc tố xạ khuẩn tiết ra môi trường nuôi cấy.

Quan sát vi thể: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I theo phương pháp tiêu bản

phòng ẩm. Sau 5-7 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng, đặc điểm vi thể của xạ khuẩn được quan sát

dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần [11].

4.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của xạ khuẩn

Nguyên tắc: nguồn cơ chất cảm ứng có trong môi trường nuôi cấy sẽ bị phân giải khi có sự

hiện của enzyme thích hợp. Sau đó, nhận biết khả năng phân hủy cơ chất của enzyme bằng

thuốc thử đặc trưng. Xác định hoạt tính của enzyme thông qua kích thước vòng phân giải

cơ chất.

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase, cellulase ngoại bào: các chủng xạ khuẩn được

cấy chấm điểm trên môi trường Gause I có chứa các nguồn cơ chất cảm ứng tương ứng là

tinh bột và CMC (carboxy methyl cellulose). Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase bằng

cách nhuộm thuốc thử Lugol và đo kích thước vòng phân giải cơ chất sau 7 ngày nuôi ủ ở

nhiệt độ phòng [12]–[14].

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease: các chủng xạ khuẩn được cấy chấm điểm trên

môi trường có bổ sung nguồn cơ chất cảm ứng là casein. Kiểm tra hoạt tính protease bằng

bằng TCA (Trichlo acetic acid) 10% và đo kích thước vòng phân giải cơ chất sau 7 ngày

nuôi ủ ở nhiệt độ phòng [15].

4.5. Sàng lọc, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn

gây bệnh

Các chủng xạ khuẩn và vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường tương ứng là Gause I broth

và LB broth. Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được sử dụng để kiểm tra khả năng kháng

khuẩn của xạ khuẩn. Dịch nuôi cấy vi khuẩn được cấy trải vào đĩa Petri chứa môi trường

LB agar và tiến hành khoan giếng thạch. Nhỏ 100µl dịch tăng sinh xạ khuẩn sau 7 ngày

nuôi cấy vào các giếng thạch đã khoan. Đem các đĩa đã cấy đi nuôi ủ và kiểm tra hoạt tính

đối kháng của xạ khuẩn với vi khuẩn chỉ thị sau 24h [16].

6

4.6. Sàng lọc, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm mốc

gây bệnh

Từ ống thạch nghiêng, giống xạ khuẩn được cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa 5ml

môi trường Gause I broth và nuôi lắc 150 rpm trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng. Hoạt tính đối

kháng với nấm mốc của dịch nuôi xạ khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán

đĩa thạch. Trên môi trường PGA, 1 cm2

thạch chứa tơ nấm được cắt và đặt vào phía đối

diện 2 lỗ thạch đã khoan. Hút 100µl dịch nuôi cấy xạ khuẩn nhỏ vào lỗ thạch. Để ở nhiệt

độ phòng, sau 2 đến 3 ngày tiến hành kiểm tra kết quả dựa vào kích thước vòng đối kháng

(D-d, mm). Trong đó D là đường kính vòng đối kháng và d là đường kính lỗ thạch [9].

Mức độ đối kháng của xạ khuẩn với nấm mốc gây bệnh được đánh giá dựa theo nghiên cứu

của Nguyễn Thới An (2014) ở mức độ kháng mạnh, kháng trung bình và kháng yếu với

kính thước vòng đối kháng lần lượt là: ≥ 20 mm, ≥ 15 mm và ≥ 10 mm [17].

4.7. Phương pháp xử lí số liệu

Sử dụng phần mềm Excel để tổng hợp tính toán các số liệu từ kết quả thu nhận được trong

quá trình thực hiện thí nghiệm.

5. Tổng kết về kết quả nghiên cứu

Đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme

ngoại bào và đối kháng vi sinh vật” đã được một số kết quả như sau:

+ 40 chủng xạ khuẩn được phân lập và làm thuần.

+ 19/40 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào, 5 chủng được ghi

nhận có hoạt tính cao.

+ 21/40 chủng xạ khuẩn được ghi nhận là có khả năng sinh tổng hợp cellulase ngoại bào, 5

chủng có hoạt tính cellulase ngoại bào mạnh.

+ 20/40 chủng xạ khuẩn được ghi nhận là có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào, 5

chủng có hoạt tính protease ngoại bào mạnh.

+ 5/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Bacillus subtilis, 12/40 chủng xạ khuẩn

có khả năng đối kháng với Bacillus cereus, 1/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với

Escherichia coli và 4/40 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với Staphylococcus aureus.