Phân lập và tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axit Lactic cao từ các sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-------*-------

NGUYỄN MẠNH TUẤN

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH AXÍT LACTIC CAO

TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN

TẠI KHU VỰC THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

Thái Nguyên - 2012

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, với xu hướng đa dạng và sản xuất hàng hoá

ngành chăn nuôi trong phạm vi của cả nước nói chung đã có những bước phát triển

khá mạnh. Cho đến nay, các sản phẩm của ngành chăn nuôi không những đã đáp

ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thu

ngoại tệ cho kinh tế quốc dân [56]. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển chăn nuôi thì

dịch bệnh ở vật nuôi cũng phát sinh và phát triển, đặc biệt là bệnh đường ruột làm

tăng tỷ lệ chết, giảm năng suất và là nguồn nhiễm tiềm tàng cho các sản phẩm, gây

ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng.

Với phát hiện khoa học về hoạt chất có khả năng kháng khuẩn của Alex

Fleming (1929) [57] việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi đã mở ra một kỷ

nguyên mới trong điều trị các bệnh truyền nhiễm và nhanh chóng đã được áp

dụng ở thế giới. Ngoài ra, kháng sinh còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ

những năm 1950 của thế kỷ 20 [56]. Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh

trong điều trị bệnh cho vật nuôi đã nảy sinh ra tính kháng thuốc của các vi sinh

vật gây bệnh và tồn dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm,.....gây ảnh

hưởng đến sức khỏe con người. Chính vì vậy, nên nhu cầu tìm ra các giải pháp

nhằm hạn chế tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật để bảo vệ vật nuôi là

vấn đề ngày càng trở nên cấp bách....[37].

Trong tự nhiên quá trình cạnh tranh sinh học xảy ra thường xuyên giữa các

loài sinh vật với nhau dẫn tới các sinh vật yếu hơn bị giảm số lượng hoặc là sẽ bị

tiêu diệt trong khu vực cư trú [20], [45]. Probiotic là chế phẩm sinh học chứa các vi

khuẩn sống, có tác động làm cân bằng hệ vi sinh vật trong đường ruột, từ đó ảnh

hưởng tốt cho động vật. Cách thức hoạt động của probiotic là cạnh tranh, qua đó tạo

nên hàng rào vật lý bảo vệ sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra,

chúng cũng sinh ra các hoạt chất kháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch

của vật nuôi [29].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

Lactobacillus là nhóm vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nhất trong chế tạo

probiotics. Các chủng Lactobacillus được tìm thấy và phân lập nhiều ở trong đường

tiêu hóa của động vật, trong các phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường và

sản phẩm lên men,... Các sản phẩm này có chứa hàm lượng axít lactic rất cao là

tiềm năng để sản xuất probiotics [42].

Các sản phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi ở nước ta hiện nay còn hạn

chế, do vậy ngành chăn nuôi đang sử dụng phần lớn các sản phẩm probiotic nhập

khẩu. Tuy nhiên, tác dụng tích cực cho vật nuôi chưa được khẳng định rõ ràng. Các

nhà khoa học cho rằng có thể là các vi sinh vật không phù hợp với hệ vi sinh vật

đường ruột của vật chủ bản địa. Mặt khác, các nghiên cứu chế tạo probiotics dùng

trong chăn nuôi ở nước ta còn rất hạn chế.

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập,

tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao từ các

sản phẩm lên men tại khu vực thành phố Thái Nguyên” với mục tiêu tuyển chọn

được một số chủng Lactobacillus có khả năng sinh axít lactic cao, chống chịu tốt

trong các điều kiện in vitro làm cơ sở cho việc chế tạo probiotic dùng trong chăn nuôi.

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập các chủng Lactobacillus

- Định lượng axít lactic sinh ra của các chủng Lactobacillus phân lập được

- Đánh giá một số đặc tính probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập được

trong điều kiện in vitro.

- Phân loại một số chủng Lactobacillus phân lập được.

Ý nghĩa khoa học của đề tài:

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở cho việc lựa chọn một số chủng vi

khuẩn lactic phân lập được có hoạt tính sinh học cao để tạo chế phẩm sinh học.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

1.1.1. Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ

Eubacteriales. Nhóm này không đồng nhất về mặt hình thái, song về mặt sinh lý

chúng tương đối đồng nhất. Tất cả đều có đặc điểm chung là những vi khuẩn Gram

dương, không sinh bào tử, không di động. Chúng thu nhận năng lượng nhờ chuyển

hóa hydrat cacbon và sinh ra axít lactic. Khác với một số vi khuẩn khác như vi

khuẩn đường ruột cũng sinh ra axít lactic, tất cả các vi khuẩn lactic đều là vi khuẩn

lên men bắt buộc, không chứa các cytocrom và enzyme catalaza, sinh trưởng tùy

tiện. Hình dạng tế bào của vi khuẩn lactic hình cầu hay hình que. Kích thước của

chúng thay đổi tùy từng loài khác nhau. Tất cả sự khác nhau về hình thái tế bào này

phụ thuộc vào môi trường, thời gian và sự có mặt của oxy cũng như các điều kiện

nuôi cấy khác [12].

1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

1.1.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Cacbon là thành tố chính trong hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi

loài sinh vật. Vì vậy sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần

thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế

bào vi sinh vật.

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose như

glucose, fructose, manose, galactose; các loại đường đôi như saccarose, lactose,

maltose cho đến các polysaccarit như tinh bột, dextrin.

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và

disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu

trúc tế bào và sinh ra các axít hữu cơ như axít citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic..

Một số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực

phẩm có thể sử dụng các axít gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axít axetic và

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

axít lactic như Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium hassice fermentatae.

Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả

các axít amin như axít glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng.

Khi đó tạo ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn khác nhau

đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau. Sự phát triển vi khuẩn lactic với mỗi loại

đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau

và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các

quá trình xử lý sau này. Khả năng sống sót của L. bulgaricus trong và sau sấy

đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu

hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỉ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với

lên men từ fructose và lactose. Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần

quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [12].

1.1.2.2. Nhu cầu về dinh dưỡng nitơ

Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống tất cả các sinh vật. Những

vật chất cơ bản của tế bào như protein, axít nucleic… đều chứa nitơ, vì vậy nitơ

đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi

khuẩn. Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiểu axít amin khác nhau do đó chúng cần môi

trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo sự phát triển của mình. Axít amin có thể

được đồng hóa dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzyme protease ngoại bào

hay nội bào.

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi

khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên

chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic

có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ có từ nguồn nitơ vô cơ như L. helveticus

chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường.

Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các

axít amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản

phẩm thủy phân protein từ pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt,

trypton… Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi

trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở qui mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

6

nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao hiệu quả sản

xuất. Trong đó nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều [12].

1.1.2.3. Nhu cầu về dinh dưỡng vitamin

Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là giống Lactobacillus, rất cần vitamin cho sự

sinh trưởng. Axít nicotinic và axít pantotenic rất cần cho sự sinh trưởng của tất cả

các loài vi khuẩn lactic. Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt

độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường [12], [32].

1.1.2.4. Các chất hữu cơ khác cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic

Axít axetic và axít xitric ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn

lactic được sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập và

bảo quản các chủng vi khuẩn lactic.

Axetat có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Axetat được

dung làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic. Một loại

axít hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi

khuẩn lactic là axít oleic, một dẫn xuất của axít oleic được sự dụng là Tween 80

trong thành phần môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic. Một vài loài vi

khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần axít

béo không no cho sự phát triển [12], [50].

1.1.2.5. Nhu cầu về các muối khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng vi khuẩn lactic rất cần các hợp chất vô cơ đa

lượng và vi lượng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan và magiê. Đặc

biệt là mangan có tác dụng ngăn cản quá trình tự phân hủy của tế bào và rất cần thiết cho

quá trình sống bình thường của vi khuẩn này. Đối với Lactobacillus thì mangan, magiê

và sắt có tác động tích cực lên sự sinh trưởng của vi khuẩn lactic [12], [45].

1.1.3. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic

Theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey’s [21] Lactobacillus được phân

loại như sau:

Ngành: Firmicutes

Lớp: Bacilli

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

7

Bộ: Eubacteriales

Họ: Lactobacillaceae

Giống: Lactobacillus

Lactobacillus thuộc nhóm các vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic gồm một số

giống trong ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính là các vi khuẩn Gram

dương và lên men carbohydrate thành năng lượng và axít lactic.

Giống Lactobacillus rất đa dạng. Sự đa dạng của chúng có thể được đánh giá

bằng hàm lượng G+C trong ADN của các loài, thường chiếm 32-53 mol%.. Điểm

đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn các giống khác là dạng hình

que và khả năng tạo ra axít lactic như một sản phẩm cuối cùng chủ yếu. Bên cạnh

đó, Lactobacillus còn là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử và hiếm

khi di động. Người ta thấy rằng tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que,

với kích thước biến đổi trong khoảng (0,5-1,2)×(1-10) m, đôi khi trông chúng có

thể gần giống như hình cầu (coccoid) trong điều kiện nào đó và thường hình thành

dạng chuỗi hoặc tồn tại đơn độc Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus trên môi

trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu. Những

tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có khả năng lên men và phân hủy

saccharose. Ít nhất một nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactose [25].

Về nhu cầu ôxy, chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, nhưng phát triển

tốt hơn trong điều kiện không có ôxy. Nhìn chung, các loài trong giống này sẽ phát

triển tốt hơn trong điều kiện có 5% CO2 [22]

Về nhu cầu dinh dưỡng, Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt.

Chúng phát triển tốt trong môi trường nhiều phức chất. Nhiệt độ phát triển tối ưu

của chúng là 30-400C, nhưng cũng có thể sinh trưởng trong phạm vi từ 5-530C.

Chúng có khả năng chịu đựng được môi trường có tính axít, pH tối ưu cho sự phát

triển là 5,5-5,8 nhưng nhìn chung có thể sinh trưởng ở pH 5 [12]

1.1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic

1.1.4.1 Ảnh hưởng của oxy