Phân lập và tinh chế hoạt chất kháng staphylococcus aureus kháng methicillin (mrsa) từ cao chiết sâm đại hành (eleutherine subaphylla gagnep.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT KHÁNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN

(MRSA) TỪ CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine

subaphylla Gagnep.)

Bình Dương, tháng 03 năm 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HOẠT CHẤT KHÁNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS KHÁNG METHICILLIN

(MRSA) TỪ CAO CHIẾT SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine

subaphylla Gagnep.)

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Xuân Sanh

Khoa: Công nghệ sinh học

Các thành viên:

Nguyễn Đoàn Thanh Liêm Lƣơng Thị Cẩm Vân

Nguyễn Châu Khoa Nguyễn Thị Trúc Ly

Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Dƣơng Nhật Linh

TS. Nguyễn Tấn Phát

Bình Dương, tháng 03 năm 2019

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ .....................................................................................ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH.....................................................................................................ii

DANH MỤC VIẾT TẮT.......................................................................................................ii

ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................................iv

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................... 4

1.1. Tổng quan về vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA)..............5

1.1.1. Vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA)..............................5

1.1.2. Tình hình MRSA kháng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam............................8

1.2. Sơ lƣợc về cây sâm đại hành ( Eleutherine subaphylla Gagn/.................................10

1.2.1. Phân loại khoa học..............................................................................................10

1.2.2. Đặc điểm hình thái.............................................................................................. 11

1.2.3. Phân bố, thu hái và chế biến ............................................................................... 12

1.2.4. Thành phần hóa học............................................................................................ 12

1.2.5. Tác dụng dƣợc lý ................................................................................................ 15

1.2.6. Công dụng........................................................................................................... 15

1.2.7. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nƣớc .............................................. 16

1.3. Khái quát về phƣơng pháp chiết cao dƣợc liệu.........................................................18

1.3.1. Khái niệm............................................................................................................ 18

1.3.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) ............................................................. 19

1.3.3. Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng............................................................................ 19

1.3.4. Cô đặc và sấy khô...............................................................................................20

1.3.5. Phƣơng pháp sắc ký cột......................................................................................21

1.3.6. Phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất...............................................22

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................. 23

2.1. Sơ đồ bố trí thí ..........................................................................................................24

2.2. Vật liệu nghiên...........................................................................................................24

2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi chiết đến khối lƣợng cao chiết...........................24

2.4. Xác định giới hạn nhiễm khuẩn của cao ch...............................................................26

2.5. Khảo sát hoạt tính kháng Staphylocuccus aureus ATCC 43300 kháng methicillin

(MRSA) của các loại cao chiết........................................................................................ 27

2.5.1. Phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch.......................................................... 27

2.5.2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với Staphylocuccus

aureus ATCC 43300 kháng methicillin (MRSA)......................................................... 28

2.6. Khảo sát các cao chiết phân đoạn bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)........28

2.7. Phƣơng pháp sắc ký cột.............................................................................................29

2.8. Phƣơng pháp xác định cấu trúc..................................................................................29

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................................ 31

3.1. Kết quả giám định tên khoa học của cây...................................................................32

3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của dung môi chiết đến khối lƣợng cao chiết...........................32

3.3. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn của cao chiết.......................................................35

3.4. Khảo sát hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết............................................35

3.5. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết với vi khuẩn MRSA..........37

3.6. Khảo sát các cao chiết phân đoạn bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)........41

3.7. Phân lập các hợp chất từ cao n-hexane của củ sâm đại hành.....................................43

3.8. Xác định cấu trúc của các hợp chất............................................................................45

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46

4.1. KẾT LUẬN...............................................................................................................47

4.2. ĐỀ NGHỊ...................................................................................................................48

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................. ..49

PHỤ LỤC.............................................................................................................................51

i

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 3.1. Khối lƣợng và hiệu suất thu hồi của các dung môi.............................................32

Bảng 3.2. Kết quả số lƣợng nấm và vi khuẩn sống có trong cao chiết................................35

Bảng 3.3. Kết quả thử khả năng kháng MRSA của các cao chiết từ sâm đại hành.............36

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu MIC đối với vi khuẩn MRSA từ cao

chiết sâm đại hành................................................................................................................38

Bảng 3.5. Kết quả sắc ký lớp mỏng (TLC)..........................................................................42

Bảng 3.6. Giá trị Rf (cm) của các tỉ lệ dung môi khảo sát (chloroform : methanol)............43

Biểu đồ 3.1. Ảnh hƣởng của dung môi đến khối lƣợng cao chiết........................................33

Biểu đồ 3.2. So sánh kết quả kháng MRSA của các loại cao chiết từ củ sâm đại hành......37

ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Hình vi thể của MRSA...........................................................................................5

Hình 1.2. Cây sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.).........................................11

Hình 1.3. Công thức hóa học của eleutherin và isoeleutherin.............................................12

Hình 1.4. Công thức hóa học của eleutherol và anthracene-9,10-dione-1,5-diol-4-methoxy￾3-methyl-2-cacboxylic acid methyl ester.............................................................................13

Hình 1.5. Công thức hóa học của mangiferin và isomangiferin..........................................13

Hình 1.6. Công thức hóa học của eleutherinone..................................................................13

Hình 1.7. Công thức hóa học của (R)-4-hydroxy eleutherin, eleuthone, eleutherinol-8-O-D￾glucoside, isoeleuthoside C, eleutherinol, eleuthoside B, eleuthoside C, elecanacin và

hongconin.............................................................................................................................14

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm...................................................................................24

Hình 2.2. Sơ đồ chiết cao sâm đại hành...............................................................................26

Hình 3.1. Thu cao n-hexane bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng......................................34

Hình 3.2. Thiết bị máy cô quay thu cao...............................................................................34

Hình 3.3. Cao n-hexane thu nhận đƣợc sau khi chiết lỏng – lỏng.......................................34

Hình 3.4. Kết quả thử hoạt tính kháng MRSA của các loại cao chiết từ củ sâm đại hành..36

Hình 3.5. MIC kháng MRSA của cao nƣớc ở nồng độ 1/32 và 1/64...................................40

Hình 3.6. MIC kháng MRSA của cao ethyl acetate ở nồng độ 1/32 và 1/64.......................40

Hình 3.7. MIC kháng MRSA của cao n-hexane ở nồng độ 1/32 và 1/64............................41

Hình 3.8. Kết quả các cao chiết phân đoạn bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) theo

các tỉ lệ khác nhau................................................................................................................41

Hình 3.9. Cao n-hexane đƣợc trộn đều với silica gel để chuẩn bị cho quá trình chạy cột...44

Hình 3.10. Ổn định silica gel trong cột sắc ký.....................................................................44

Hình 3.11. Cột sắc ký thu phân đoạn 1................................................................................44

Hình 3.12. Cột sắc ký thu phân đoạn 2................................................................................44

Hình 3.13. Khảo sát khả năng kháng MRSA của ES-H1 và ES-H2...................................45