Phân Lập Và Mô Tả Đặc Điểm Tuyến Trùng Có Khả Năng Diệt Sâu Hại Từ Mẫu Đất Tỉnh Quảng Nam 74

i

LỜI CẢM ƠN

Đƣợc sự đồng ý của Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, lãnh

đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và giáo viên hƣớng dẫn tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và định danh các

chủng nấm men ứng dụng tạo chế phẩm Probiotic trong chăn nuôi’’.

Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc và tích cực đến nay đề

tài về cơ bản đã hoàn thành. Để có đƣợc kết quả này trƣớc hết tôi xin chân

thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng và Th.S Nguyễn

Thị Hồng Nhung thuộc bộ môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh - Viện Công nghệ

sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn

trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp,

ban lãnh đạo và cán bộ nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đã

tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này.

Mặc dù đã cố gắng để hoàn thành đề tài song do hạn chế về mặt thời

gian, kinh nghiệm bản thân và điều kiện nghiên cứu nên không thể tránh khỏi

những thiếu sót và tồn tại nhất định. Tôi kính mong nhận đƣợc những lời

nhận xét, đóng góp ý kiến của các thầy cô.

Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Lê Bá Minh Tuấn

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................iv

DANH MỤC BẢNG......................................................................................... v

DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... vi

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................... 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU......................................... 3

1.1. Tổng quan về nấm men. ............................................................................. 3

1.1.1. Định nghĩa thuật ngữ nấm men .............................................................. 3

1.1.2. Các đặc điểm của nấm men .................................................................... 3

1.1.3. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nấm men ........................................... 5

1.2. Giới thiệu về chế phẩm Probiotic sử dụng trong chăn nuôi....................... 7

1.3. Đặc điểm chung của vi sinh vật Probiotic.................................................. 8

1.3.1. Chịu muối mật ........................................................................................ 8

1.3.2. Chịu pH thấp........................................................................................... 8

1.3.3. Chịu kháng sinh ...................................................................................... 8

1.3.4. Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột.......................................... 9

1.4. Vai trò của probiotic với vật nuôi ............................................................ 10

1.5. Phân loại vi sinh vật ................................................................................. 11

1.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt Nam ... 11

1.6.1. Trên thế giới ......................................................................................... 11

1.6.2. Tại Việt Nam ........................................................................................ 13

PHẦN 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU................................................................................................ 15

2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 15

2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 15

2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15

2.4. Môi trƣờng nghiên cứu............................................................................. 16

2.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu................................................................... 17

iii

2.5.1. Phân lập các chủng vi sinh vật hữu ích ................................................ 17

2.5.2. Phƣơng pháp bảo quản giống ............................................................... 17

2.5.3. Tuyển chọn các chủng có đặc tính probiotic ........................................ 18

2.5.4. Xác định mật độ tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. ................ 24

2.5.5. Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa của các chủng vi sinh vật . ............ 24

2.5.6. Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử.................... 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 28

3.1. Phân lập các chủng nấm men ................................................................... 28

3.2. Tuyển chọn các chủng nấm men có đặc tính Probiotic............................ 30

3.2.1. Khảo sát hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định....................... 30

3.2.2. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào .......................................... 31

3.2.3. Khảo sát khả năng chịu pH dạ dày....................................................... 33

3.2.4. Khảo sát khả năng chịu muối mật......................................................... 34

3.2.5. Khả năng đề kháng chất kháng sinh của các chủng vi sinh.................. 36

3.2.6. Xác định khả năng bám dính vào màng nhầy niêm mạc ruột............... 37

3.3. Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng Probiotic ......................................... 38

3.3.1. Định danh vi khuẩn bằng phƣơng pháp sinh học phân tử.................... 40

3.3.2. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng N.CT.......................... 41

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 43

4.1. Kết luận .................................................................................................... 43

4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO

iv

DANH MỤC VIẾT TẮT

Ký hiệu Chú thích

CFU Colony-Forming Unit

CMC Carboxymethiylcellulose

ĐC Đối chứng

DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

ITS Internal Transcribed Spacer

MPA Meat-Peptone Agar

MT Môi trƣờng

NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Axít ribonucleic

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

TB Tế bào

TE buffer

10 mM Tris-HCl (pH 8.0)

0.1 mM EDTA

VK Vi khuẩn

VSV Vi sinh vật

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học các

chủng vi sinh vật hữu ích ................................................................................ 28

Bảng 3.2. Kết quả vòng kháng vi sinh vật kiểm định..................................... 30

Bảng 3.3. Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật.................. 31

Bảng 3.4. Tỉ lệ TB sống sót (%) của các chủng theo thời gian ở các mức pH33

Bảng 3.5. Tỉ lệ tế bào (%) của các chủng theo thời gian ở các nồng độ muối

mật khác nhau.................................................................................................. 35

Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng....................................... 36

Bảng 3.7. Khả năng bám dính trên màng nhầy niêm mạc ruột của các chủng38

Bảng 3.8. Khả năng lên men các loại đƣờng của các chủng........................... 39

Bảng 3.9. Tổng hợp một số đặc tính probiotic của chủng N.CT.................... 41