Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô (bắp) (Zea mays L.) trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐẶNG THỊ NGỌC THANH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN TRONG ĐẤT

VÙNG RỄ VÀ VI KHUẨN NỘI SINH CÂY NGÔ

(BẮP) (Zea mays L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM

VÙNG ĐÔNG NAM BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC

Mã số 62 42 01 07

Cần Thơ, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐẶNG THỊ NGỌC THANH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN TRONG ĐẤT

VÙNG RỄ VÀ VI KHUẨN NỘI SINH CÂY NGÔ

(BẮP) (Zea mays L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM

VÙNG ĐÔNG NAM BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC

Mã số 62 42 01 07

Người hướng dẫn khoa học

Gs. Ts. CAO NGỌC ĐIỆP

Cần Thơ, 2017

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ và hỗ

trợ thật quý báu của nhiều người. Xin được bày tỏ lòng tri ân chân thành và

sâu sắc!

Lời cảm ơn đầu tiên xin được gửi đến Thầy tôi, Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp. Thầy

đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy các phương pháp tiếp cận khoa học trong

lĩnh vực nghiên cứu, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt

quá trình học tập và thực hiện luận án tiến sĩ.

Chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công

Nghệ Sinh học đã truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức quý báu, phục vụ quá

trình nghiên cứu và viết các báo cáo khoa học.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh

đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo,

Phòng Quản lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của

Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt quá

trình học tập và nghiên cứu tại trường.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sài Gòn, Ban Lãnh

đạo Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và

tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh.

Chân thành gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện

Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và

Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã quan tâm, giúp

đỡ và động viên tôi.

Xin cảm ơn gia đình anh Nguyễn Văn Đẹp đã hỗ trợ đất và công sức canh tác

giúp tôi triển khai thực hiện các thí nghiệm ngoài đồng. Chân thành cảm ơn

các em sinh viên Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường

Đại học Cần Thơ và Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài

Gòn đã cộng tác cùng tôi trong thời gian thực hiện thí nghiệm.

Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến em Nguyễn Thị Xuân Mỵ, người đồng

hành cùng tôi, và các em Lê Duy Tín, Lê Minh Đức, Mai Thị Trà Giang đã hỗ

trợ tôi rất nhiều trong quá trình triển khai và thực hiện nghiên cứu.

Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những người thân trong gia

đình, chồng và các con đã hết lòng ưu ái, động viên và tạo mọi điều kiện thuận

lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc xa nhà.

Đặng Thị Ngọc Thanh

ii

TÓM TẮT

Ngô là cây lương thực quan trọng và là nguồn cung cấp nguyên liệu cho

công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ở Đông Nam Bộ. Đất xám là một

trong bốn loại đất trồng ngô chính của vùng, nhưng do có đặc tính nghèo dinh

dưỡng nên để duy trì sản lượng cao, người ta thường sử dụng một lượng lớn

phân hóa học, đặc biệt là phân đạm. Điều này đã góp phần làm gia tăng chi phí

sản xuất, và gây tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người.

Hướng tới sự sản xuất ngô bền vững và giảm sự lệ thuộc vào phân bón hóa

học, cần thiết phải tìm kiếm và khai thác lợi ích của các loại vi khuẩn có khả

năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật. Do vậy, đề tài “Phân lập, tuyển chọn và

nhận diện vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ và vi khuẩn nội

sinh cây ngô (bắp) (Zea mays L.) trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ” đã

được thực hiện nhằm mục tiêu tìm kiếm nguồn vi khuẩn bản địa có khả năng bổ

sung hai nguyên tố quan trọng là N và P cho cây ngô.

Sử dụng các loại môi trường không đạm (Burk’s, NFb, LGI) cùng với môi

trường NBRIP chứa lân khó tan để phân lập các dòng vi khuẩn có cả hai khả

năng cố định đạm và hòa tan lân. Khảo sát định lượng bằng phương pháp so

màu giúp tuyển chọn các dòng có khả năng cố định đạm và hòa tan lân in vitro

tốt. Tiến hành nhận diện các dòng này thông qua trình tự gene 16S rRNA bằng

các kỹ thuật sinh học phân tử và công cụ tin sinh học và khảo sát thêm các đặc

tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác như sự tổng hợp IAA và siderophore

nhằm chọn ra một số dòng đưa vào thử nghiệm trên cây ngô trồng trong chậu

và ngoài đồng. Kết quả thu được là 180 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 319

dòng vi khuẩn nội sinh có cả 2 khả năng cố định N và hòa tan P. Năm mươi

lăm dòng tuyển chọn có sự tương đồng trình tự 16S rDNA với các chủng vi

khuẩn có trong GenBank (NCBI) với mức độ tương đồng từ 97% - 100%, trong

đó chủ yếu thuộc về các chi Burkholderia, Enterobacter và Bacillus. Tất cả các

dòng tuyển chọn đều có khả năng sản xuất IAA, hơn thế dòng DDN10b còn có

khả năng sản xuất siderophore. Thử nghiệm khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực

vật in vivo cho thấy 2 dòng DDN10b (Burkholderia sp.) và VTN2b (Bacillus

subtilis) là các ứng viên có tiềm năng sử dụng như các chế phẩm phân bón vì

giúp tiết kiệm 25% phân N và P hóa học, đồng thời làm tăng năng suất thêm

11,7 - 24,9%.

Các nghiên cứu đã được đề xuất là tiếp tục đánh giá các hoạt tính thúc đẩy

tăng trưởng thực vật khác của các dòng tuyển chọn, và tiếp tục đánh giá hiệu

iii

quả của 2 dòng DDN10b và VTN2b trên các giống ngô trồng tại các vùng

trọng điểm của Đông Nam Bộ.

Từ khóa: cố định đạm, đất xám, hòa tan phosphate, thúc đẩy tăng

trưởng thực vật, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn đất vùng rễ.

iv

ABSTRACT

Maize is one of the most important food crops and the source of animal

feed manufacturing industry in the Southeast of Vietnam. In this region, acrisols

is one of the four main soil groups used for maize production, but due to its poor

nutritional character, it is common to use large amounts of chemical fertilizers,

especially nitrogen fertilizers to maintain high yields. This contributes to

increased production costs, and has a negative impact on the environment and

human health. Towards sustainable maize production and reducing dependence

on chemical fertilizers, it is necessary to seek out and exploit the benefits of

plant promoting bacteria. Therefore, the topic “Isolation, selection and

identification of nitrogen fixation and phosphate solubilization rhizopheric

bacteria and endophytic bacteria from maize (Zea mays L.) grown on acrisol

soils of the Southeast” was made to target indigenous bacteria having the

capability of supplementing two important macronutrients as nitrogen and

phosphorus for maize.

N-free media (Burk’s, NFb, LGI) and NBRIP medium containing

insoluble inorganic phosphate were used to isolate bacteria having both nitrogen

fixation and phosphate solubilization characteristics. Quantitative measurement

by colorimetric methods helped to select the best isolates of nitrogen-fixing and

phosphate-solubilizing bacteria. Identification of these isolates based on 16S

rDNA sequences by molecular biological techniques and bioinformatics tools

and exploring further plant growth promoting features such as IAA synthesis

and siderophore synthesis were employed to select some isolates for testing in

potted and field maize.

The result of isolation was a total of 180 rhizopheric and 319 endophytic

isolates having the both abilities. Fifty-five selected isolates had 16S rDNA

sequences similarities with bacterial strains in data of GenBank (NCBI) with the

values ranging between 97% and 100% of similarity in which the majority was

Burkholderia, Enterobacter and Bacillus genera. All selected isolates are

capable of producing IAA; moreover the isolate DDN10b having siderophore

producing ability. The in vivo plant growth promoting experiments

demonstrated that two isolates of DDN10b (Burkholderia sp.) and VTN2b

(Bacillus subtilis) are potentially candidates for using as fertilizer inoculants

because helping to save 25% of total standard mounts of N and P fertilizers and

improved the yields of maize up further from 11.7% to 24.9%.

The next suggested studies will be other plant growth promotion potentials

evaluations as well as continue to assess the effectiveness of the two bacterial

v

strains DDN10b and VTN2b on maize planting in the key areas of the

Southeast.

Keywords: acrisols, endophytic bacteria, nitrogen fixation, phosphate

solubilization, plant growth promoting, rhizospheric bacteria.

vi

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên

cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận

văn cùng cấp nào khác.

Ngày……………….

Nghiên cứu sinh

Đặng Thị Ngọc Thanh

vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN............................................................................................... i

TÓM TẮT..................................................................................................... ii

ABSTRACT.................................................................................................. iv

LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................... vi

MỤC LỤC .................................................................................................... vii

DANH SÁCH BẢNG................................................................................... xi

DANH SÁCH HÌNH .................................................................................... xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... xvii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU........................................................................ 1

1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................. 3

1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................... 3

1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 3

1.5. Nội dung nghiên cứu.............................................................................. 3

1.6. Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án ................................................... 4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................... 6

2.1. Hiện trạng sản xuất ngô trên đất xám vùng Đông Nam Bộ................... 6

2.1.1. Đặc điểm của đất xám vùng Đông Nam Bộ ....................................... 6

2.1.2. Đặc điểm của vùng ngô Đông Nam Bộ .............................................. 9

2.1.3. Tình hình sử dụng phân bón và thuốc trừ sâu ở Đông Nam Bộ ........ 12

2.2. Ứng dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật: một cách tiếp

cận tiềm năng của nông nghiệp bền vững .................................................... 15

2.2.1. Khái niệm nông nghiệp bền vững....................................................... 15

2.2.2. Mối quan hệ giữa thực vật với các loại vi khuẩn liên hiệp thực vật ...... 17

2.2.3. Vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh thực vật và các khái niệm

liên quan ....................................................................................................... 18

2.2.4. Cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và

vi khuẩn nội sinh thực vật............................................................................. 19

2.2.5. Sử dụng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật như các loại chế

phẩm chủng cho cây trồng............................................................................ 26

2.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô trên

thế giới .......................................................................................................... 30

2.3.1. Sưu tập và xác định đặc tính của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn

nội sinh cây ngô ............................................................................................ 30

2.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn

nội sinh cây ngô dựa trên trình tự gene 16S rRNA ...................................... 38

viii

2.3.3. Dò tìm các gene nif và nifH trong nghiên cứu khuẩn vùng rễ và vi

khuẩn nội sinh BNF ..................................................................................... 45

2.3.4. Nghiên cứu khả năng ứng dụng của các vi khuẩn vùng rễ và vi

khuẩn nội sinh trong canh tác ngô ................................................................ 46

2.4. Triển vọng và thách thức trong nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn

thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở ngô và các cây trồng khác ......................... 49

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........... 52

3.1. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................ 53

3.1.1. Loại đất và các giống ngô thu mẫu...................................................... 53

3.1.2. Các giống ngô trồng thử nghiệm hiệu quả PGP ................................. 53

3.1.3. Đất xám trong thí nghiệm trồng ngô................................................... 54

3.1.4. Phân bón hóa học và liều lượng.......................................................... 54

3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.............................................................. 55

3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 55

3.3.1. Thu thập và xử lý mẫu ........................................................................ 55

3.3.2. Phân tích đặc tính dinh dưỡng của đất................................................ 58

3.3.3. Xác định mật số tế bào vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất

vùng rễ cây ngô và tìm hiểu sự tương quan tuyến tính với các chỉ tiêu

dinh dưỡng của đất........................................................................................ 58

3.3.4. Phân lập các vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ cây

ngô ................................................................................................................ 62

3.3.5. Phân lập các vi khuẩn nội sinh cố định đạm và hòa tan lân từ thân

và rễ cây ngô ................................................................................................. 63

3.3.6. Xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và sự chuyển động

của các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân ...................................... 65

3.3.7. Xác định Gram của các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân... 66

3.3.8. Bảo quản các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân................... 67

3.3.9. Khảo sát định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các

dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô ............................................ 67

3.3.10. Tuyển chọn các dòng cố định đạm và hòa tan lân tốt từ bộ sưu tập

các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô...................................... 72

3.3.11. Nhận diện các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã

tuyển chọn..................................................................................................... 72

3.3.12. Một số nghiên cứu “đặc tính hóa phân tử” trên các dòng vi khuẩn

tuyển chọn ..................................................................................................... 77

3.3.13. Khảo sát đặc tính sinh tổng hợp IAA và siderophore của các dòng

vi khuẩn tuyển chọn...................................................................................... 79

ix

3.3.14. Khảo sát khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các dòng vi

khuẩn tuyển chọn trên cây ngô lai một tháng tuổi trồng trong chậu ............ 81

3.3.15. Khảo sát tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên các yếu

tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết ở cây ngô lai trồng trong

chậu............................................................................................................... 84

3.3.16. Khảo sát tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên năng

suất lý thuyết và năng suất thực thụ ở cây ngô lai trồng ngoài đồng ........... 87

3.4. Xử lý dữ liệu .......................................................................................... 90

3.4.1. Đối với các thí nghiệm có sử dụng phép đo OD ................................ 90

3.4.2. Đối với các thí nghiệm giá hiệu quả PGP in vivo trên cây ngô.......... 90

3.4.3. Đối với các phân tích Tin sinh học ..................................................... 91

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 92

4.1. Mối quan hệ giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân với đặc

tính dinh dưỡng của đất xám trồng ngô vùng Đông Nam Bộ ...................... 92

4.1.1. Đặc tính dinh dưỡng của đất xám trồng ngô vùng Đông Nam Bộ ..... 92

4.1.2. Mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô.... 95

4.1.3. Tương quan tuyến tính đơn giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa

tan lân trong đất vùng rễ cây ngô với các chỉ tiêu dinh dưỡng của đất ........ 96

4.2. Kết quả phân lập các vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng

rễ và trong thân, rễ cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ ................ 98

4.3. Đặc tính hình thái khuẩn lạc và tế bào của các vi khuẩn cố định đạm

và hòa tan lân được phân lập từ đất vùng rễ và từ thân và rễ cây ngô trồng

trên đất xám vùng Đông Nam Bộ ................................................................. 102

4.4. Khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng

rễ và nội sinh cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ ................... 105

4.4.1. Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội

sinh cây ngô .................................................................................................. 105

4.4.2. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh

cây ngô.......................................................................................................... 108

4.4.3. Đặc tính cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất

vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn................................................... 111

4.5. Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô

đã tuyển chọn ................................................................................................ 116

4.5.1 Kết quả định Gram và trích lục hồ sơ (profile) của các dòng vi

khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn.................................. 116

4.5.2. Kết quả khuếch đại và giải trình tự một phần gene 16S rRNA của

các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn .............. 117

x

4.5.3. Kết quả dò tìm dòng tương đồng trình tự gene 16S rRNA trong cơ

sở dữ liệu của GenBank................................................................................ 118

4.5.4. Kết quả tìm hiểu quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên trình tự

gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn tuyển chọn ..................................... 124

4.6. Kết quả của một số phân tích Sinh học phân tử trên các dòng vi

khuẩn tuyển chọn .......................................................................................... 133

4.6.1. Quan hệ di truyền giữa các vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội

sinh đã tuyển chọn ........................................................................................ 133

4.6.2. Kết quả dò tìm gene nifH ở các vi khuẩn nội sinh cây ngô ................ 135

4.6.3. Đa dạng di truyền gene 16S rRNA của các vi khuẩn nội sinh cây ngô.. 137

4.7. Đặc tính sinh tổng hợp IAA và siderophore của các dòng vi khuẩn

tuyển chọn..................................................................................................... 139

4.7.1. Đặc tính sinh tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn tuyển chọn ........ 139

4.7.2. Đặc tính sinh tổng hợp siderophore của các dòng vi khuẩn tuyển chọn 143

4.8. Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các dòng vi khuẩn tuyển

chọn trên cây ngô lai 1 tháng tuổi trồng trong chậu ..................................... 146

4.9. Tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên các yếu tố cấu thành

năng suất và năng suất lý thuyết ở cây ngô lai trồng trong chậu.................. 149

4.10. Tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên năng suất lý thuyết

và năng suất thực thụ ở cây ngô lai trồng ngoài đồng .................................. 161

4.11. Thảo luận thêm về khả năng an toàn sinh học và hiệu quả kinh tế khi sử

dụng các dòng vi khuẩn tuyển chọn trong canh tác và sản xuất ngô lai giống

Wax48 ........................................................................................................... 174

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................ 178

5.1. Kết luận.................................................................................................. 178

5.2. Đề xuất................................................................................................... 179

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 180

PHỤ LỤC.....................................................................................................

xi

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng ngô ở các tỉnh

thành vùng Đông Nam Bộ, năm 2010 .......................................................... 9

Bảng 2.2: Một số khoản đầu tư cho canh tác ngô ở các vùng sinh thái

nông nghiệp theo điều tra của IFAD-CIMMYT, năm 2001......................... 14

Bảng 2.3: Các dạng PGPR và cơ chế hoạt động kích thích tăng trưởng

thực vật.......................................................................................................... 28

Bảng 3.1: Công thức môi trường Burk’s...................................................... 59

Bảng 3.2: Công thức môi trường NBRIP ..................................................... 60

Bảng 3.3: Công thức môi trường TSA.......................................................... 64

Bảng 3.4: Công thức môi trường LGI .......................................................... 64

Bảng 3.5: Công thức môi trường NFb .......................................................... 65

Bảng 3.6: Công thức các hóa chất dùng trong nhuộm Gram ....................... 66

Bảng 3.7: Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn NH4+ ........ 70

Bảng 3.8: Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn P2O5 ......... 71

Bảng 3.9: : Công thức môi trường LB.......................................................... 73

Bảng 3.10: Thành phần phản ứng PCR đối với vi khuẩn đất vùng rễ .......... 74

Bảng 3.11: Thành phần phản ứng PCR đối với vi khuẩn nội sinh ............... 75

Bảng 3.12: Thành phần thuốc thử Fe-HClO4 và nồng độ của đường chuẩn

IAA ............................................................................................................... 80

Bảng 3.13: Mô tả nghiệm thức và liều lượng phân NPK trong thí nghiệm

chậu nhỏ (0,5 L)............................................................................................ 83

Bảng 3.14: Mô tả nghiệm thức và liều lượng phân NPK trong thí nghiệm

chậu lớn (8,0 L)............................................................................................. 84

Bảng 3.15: Mô tả nghiệm thức và liều lượng phân NPK trong thí nghiệm

ngoài đồng..................................................................................................... 89

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu dinh dưỡng của đất xám trồng ngô và mật số vi

khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô tại 30 điểm thu

mẫu................................................................................................................ 93

Bảng 4.2: Hệ số tương quan và phương trình hồi quy đơn giữa mật số vi

khuẩn cố định đạm/hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô với một số chỉ

tiêu dinh dưỡng của đất................................................................................. 96

Bảng 4.3: Nguồn gốc và môi trường phân lập của 499 dòng vi khuẩn cố

định đạm và hòa tan lân ................................................................................ 99

Bảng 4.4: Số dòng vi khuẩn đất vùng rễ và số dòng vi khuẩn nội sinh

tương ứng với khoảng nồng độ NH4+ đo được tại 4 thời điểm khảo sát..... 105

xii

Bảng 4.5: Số dòng vi khuẩn đất vùng rễ và số dòng vi khuẩn nội sinh

tương ứng với khoảng nồng độ phosphate hòa tan đo được tại 4 thời điểm

khảo sát ......................................................................................................... 108

Bảng 4.6: Các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô

được tuyển chọn và kết quả định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan

lân tương ứng ................................................................................................ 111

Bảng 4.7: Thông tin về các chủng có khả năng tương đồng cao nhất hiện

có trong GenBank, NCBI.............................................................................. 119

Bảng 4.8: Đa dạng nucleotide trong trình tự gene 16S rRNA của các

nhóm vi khuẩn nội sinh................................................................................. 138

Bảng 4.9: Kết quả định lượng khả năng sinh tổng hợp IAA của các dòng

PAB đã tuyển chọn trong điều kiện không bổ sung và có bổ sung 100

mg/L trp ........................................................................................................ 140

Bảng 4.10: Tóm tắt đặc tính PGP in vitro của 12 dòng PAB tuyển chọn .... 144

Bảng 4.11: Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn và các mức

bón phân NPK trên cây ngô 1 tháng tuổi trồng trong chậu .......................... 146

Bảng 4.12: Ảnh hưởng của giống ngô và kiểu bón phối hợp hai dòng vi

khuẩn tuyển chọn với các mức phân NP hóa học trên một số đặc tính sinh

trưởng phát triển của giống ngô lai Wax48 và LVN10 trồng trong chậu ở

thời điểm thu hoạch ...................................................................................... 150

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của giống ngô và kiểu bón phối hợp hai dòng vi

khuẩn tuyển chọn với các mức phân NP hóa học trên một số yếu tố cấu

thành năng suất và năng suất lý thuyết của ngô hạt...................................... 157

Bảng 4.14 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn và các mức

phân NP hóa học trên một số đặc điểm sinh trưởng phát triển, các yếu tố

cấu thành năng suất và năng suất của cây ngô giống Wax48 trồng ngoài

đồng ............................................................................................................. 162

Bảng 4.14 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn và các mức

phân NP hóa học trên một số đặc điểm sinh trưởng phát triển, các yếu tố

cấu thành năng suất và năng suất của cây ngô giống Wax48 trồng ngoài

đồng (tiếp theo)............................................................................................. 163

Bảng 4.15: Hiệu quả của các nghiệm thức phối hợp vi khuẩn và phân hóa

học so với đối chứng sử dụng 100% phân hóa học ...................................... 169

xiii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Một phẫu diện đất xám trên phù sa cổ ở tỉnh Bình Dương, Việt

Nam và một phẫu diện tự nhiên lộ ra do xói mòn của đất acrisol có màu

đỏ vàng.......................................................................................................... 7

Hình 2.2: Các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn nội

sinh hoặc vi khuẩn liên hiệp với thực vật ..................................................... 20

Hình 2.3: Màng mỏng do vi khuẩn nội sinh tạo thành trong các loại môi

trường vô đạm bán đặc sau 2 DAI và sau 7 DAI.......................................... 32

Hình 2.4: Các vi khuẩn nội sinh Pseudomonas putida trong quản bào

mạch gỗ của cây dương và trong vỏ rễ của cây đậu ..................................... 32

Hình 2.5: Vòng halo trên các loại môi trường chứa lân khó tan .................. 33

Hình 2.6: Phản ứng của IAA với thuốc thử của một số dòng vi khuẩn đất

vùng rễ .......................................................................................................... 35

Hình 2.7: Chỉ thị khả năng sản xuất siderophore trên môi trường thạch

CAS và CAS lỏng......................................................................................... 37

Hình 2.8: Khả năng kháng nấm bệnh Stenocarpella maydis của một số

chủng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác ngô ở Mexico ............................... 37

Hình 2.9: Vị trí tương đối của cặp mồi p515FPL và p13B trên gene 16S

rRNA và kích thước sản phẩm khuếch đại khoảng 904 bp .......................... 40

Hình 2.10: Hai mươi ba chi vi khuẩn nội sinh ưu thế thường gặp ở 17 loại

cây trồng trên thế giới .................................................................................. 44

Hình 2.11: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của PGPR trên sự nảy

mầm của hạt và trên cây ngô trồng trong chậu 20 ngày tuổi ....................... 48

Hình 3.1: Lưu đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm............................................. 52

Hình 3.2: Bản đồ đất vùng Đông Nam Bộ và các vị trí thu mẫu.................. 56

Hình 3.3: Quy trình pha loãng mẫu và đếm sống nhỏ giọt để xác định mật

số vi khuẩn .................................................................................................... 61

Hình 3.4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR để khuếch đại gene 16S rRNA

của vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô ................................................................. 75

Hình 3.5: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR để khuếch đại gene 16S rRNA

của vi khuẩn nội sinh cây ngô....................................................................... 75

Hình 3.6: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene nifH ............... 78

Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng cây trong chậu 0,5 L theo kiểu CRD . 83

Hình 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng cây trong chậu 8,0 L theo kiểu CRD . 86

Hình 3.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng cây ngoài đồng theo kiểu lô phụ .. 88

Hình 4.1: “Đếm sống nhỏ giọt” để xác định mật số vi khuẩn cố định đạm trên

môi trường Burk’s và mật số vi khuẩn hòa tan lân trên môi trường NBRIP...... 95