Phân lập gen mã hóa protein vận chuyển lipit (LTP2) từ mRNA phục vụ chuyển gen ở cây đậu xanh

Nguyễn Vũ Thanh Thanh và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 85(09)/1: 127 - 131

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 127 http://www.lrc-tnu.edu.vn

PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA PROTEIN VẬN CHUYỂN LIPIT (LTP2)

TỪ mRNA PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU XANH

Nguyễn Vũ Thanh Thanh1*, Võ Minh Hòa1

,

Hoàng Hà2

, Lê Văn Sơn2

, Chu Hoàng Mậu3

1

Trường ĐH Khoa học - ĐH Thái Nguyên

2Viện Công nghệ sinh học,3 Đại học Thái Nguyên

TÓM TẮT

Lipid Transfer Protein (LTP) là protein có khả năng vận chuyển lipid qua màng tế bào và liên quan

đến tính chịu hạn ở thực vật. Khi gặp hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có

thể giảm mất nƣớc nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài. Những nghiên cứu trên cây đậu xanh đã cho

thấy hàm lƣợng mRNA của LTP sẽ tăng lên trong các điều kiện bất lợi nhƣ hạn, mặn hay khi hàm

lƣợng ABA ngoại bào cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng giống đỗ xanh Mỹ Đức-Hà

Nội (HN2) để phân lập gen LTP2 từ mRNA. Kết quả phân tích trình tự gen LTP2 cho thấy, gen

phân lập đƣợc có độ dài 351 bp, mã hóa cho 116 amino acid. Kết quả này là cơ sở để tạo cây trồng

chuyển gen mang gen LTP, tăng cƣờng tính chống chịu với điều kiện mất nƣớc và khô hạn.

Từ khóa: Đậu xanh, gen LTP, chịu hạn, phân lập gen.

MỞ ĐẦU*

Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) là cây

trồng cạn có vai trò quan trọng bởi nó cung

cấp protein và có tác dụng cải tạo đất. Tuy

nhiên, đậu xanh là cây trồng chịu hạn kém.

Để nâng cao khả năng chịu hạn của cây trồng

nói chung và cây đậu xanh nói riêng, hiện nay

các nhà khoa học thƣờng tạo cây chuyển gen

mang một hoặc một số gen liên quan đến khả

năng chịu hạn. LTP thuộc họ gen

pathogenesis relate, là một trong các gen chức

năng có liên quan đến khả năng chịu hạn. Vai

trò của LTP là tham gia vào quá trình sinh

tổng hợp biểu bì ở thực vật giúp hạn chế sự

mất nƣớc trong điều kiện khô hạn [1], [2], [4].

Các nghiên cứu đã cho thấy LTP có khả năng

tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho

quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào.

LTP đƣợc gắn tại một vị trí cố định trên màng

sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm nhƣ một

receptor vận chuyển acid béo qua màng tế

bào. Phức hợp LTP-linoleic acid đã đƣợc

chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá

trong điều kiện gây hạn nhân tạo [5]. LTP đã

đƣợc chiết ra từ protein ở các loài thực vật

khác nhau và hàm lƣợng cao nhất LTP đã

đƣợc tìm thấy ở lớp biểu bì bên ngoài cũng

nhƣ xung quanh các gân lá. Gen LTP điều

khiển và tổng hợp nên các sản phẩm protein

tƣơng ứng tham gia xúc tác sự vận chuyển

phospholipid giữa các lớp màng tế bào, hỗ trợ

việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp

cây hạn chế mất nƣớc [3].

*

Tel: 0912664126; Mail: [email protected]

Hiện nay , cùng với sự phát triển của công

nghệ sinh họ c , các nghiên cứu sinh học phân

tử, di truyền và hóa sinh liên quan đến tính

chịu hạn mới ở thực vật đã đƣợc làm sáng tỏ.

Nhiều gen mới đã đƣợc phát hiện và đƣợ c

nghiên cứu chức năng trên các đối tƣợng cây

mô hình khác nhau . Trong đó có gen mã hóa

Lipid Transfer Protein (LTP) liên quan đến

sinh tổng hợp lớp biểu bì của cây trồng . Đây

là cơ sở quan trọng cho việc cải tạo giống cây

trồng, nhằm tăng khả năng chống chịu.

Dựa vào trình tự của gen mã hoá protein LTP

đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế với

mã số AY300807, chúng tôi đã thiết kế cặp

mồi đặc hiệu để khuếch đại gen mã hoá protein

LTP2 của đậu xanh bằng kỹ thuật RT-PCR,

nhằm phục vụ cho việc thiết kế vector chuyển

gen. Gen LTP đƣợc nhân lên bằng phƣơng

pháp RT-PCR sau đó gắn vào vector để dòng

hoá và xác định trình tự nucleotide của gen.

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

Giống đậu xanh địa phƣơng của Mỹ Đức-Hà

Nội (kí hiệu HN2) có đặc điểm: năng suất

cao, vỏ hạt màu xanh mỡ, khối lƣợng 1000

hạt khoảng 57,32 g.

Phương pháp

RNA tổng số đƣợc tách từ lá cây đậu xanh sử

dụng kit Trilzol Regents (Invitrogen).Từ

RNA tổng số chúng ta tiến hành tổng hợp

cDNA đƣợc tạo ra trong 20 l dung dịch có

chứa 5 g RNA tổng số; 200 ng mồi ngẫu

nhiên; 2 l dNTPs 10 mM; bổ sung nƣớc khử