Phân lập đoạn gen CP từ soybean Mosaic Virus và phát triển Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây chuyển gen kháng bệnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LÒ THỊ MAI THU

PH¢N LËP §O¹N GEN CP Tõ SOYBEAN MOSAIC VIRUS

Vµ PH¸T TRIÓN VECTOR CHUYÓN GEN MANG CÊU TRóC RNAi

PHôC Vô T¹O C¢Y §ËU T¦¥NG CHUYÓN GEN KH¸NG BÖNH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Chu Hoàng Mậu

2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các kết quả

trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các Tạp

chí khoa học với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại

chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS Chu

Hoàng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá

trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin cảm ơn Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, cảm ơn

TS. Lê Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ , Phòng

Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ,

truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong quá trình nghiên cứu và

thực hiện đề tài luận án. Xin cảm ơn sự giúp đỡ ThS

, ThS .

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm cùng tập thể cán bộ

Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận án.

Tôi xin cảm ơn các thầy cô Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp và Bộ phận

quản lý nghiên cứu sinh, Phòng đào tạo, trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Thái

Nguyên, xin cảm ơn Lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm và Lãnh đạo Đại học

Thái Nguyên.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Ban chủ nhiệm khoa Sinh-

.

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và thực hiện thành công luận án này.

Nghiên cứu sinh

Mai Thu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan................................................................................................... i

Lời cảm ơn...................................................................................................... ii

Mục lục........................................................................................................... iii

............................................................... vi

................................................................... viii

.................................................................... x

MỞ ĐẦU........................................................................................................ 1

1. Đặt vấn đề …………………………………………………........……….. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu……………………………………….........……….. 2

3. Nội dung nghiên cứu………………………………………........……….. 3

4. Những đóng góp mới của luận án…………………………....................... 3

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn……………………………........………… 4

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………....................... 5

1.1. BỆNH KHẢM DO VIRUS Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG……….........…….. 5

1.1.1. ệnh virus ở cây đậu tƣơng………………......…… 5

1.1.2. Sự xâm nhập của SMV và BYMV vào tế bào đậu tƣơng….........…… 9

1.1.3. Hệ gen của SMV và BYMV…………………………….........……… 10

1.2. NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG....................... 16

1.2.1. ......…..

16

1.2.2. Định hƣớng ứng dụng và một số thành tựu về chuyển gen ở cây

đậu tƣơng………………………………..........…………………………….. 23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

iv

1.2.3. Tình hình nghiên cứu tạo cây đậu tƣơng biến đổi gen ở Việt Nam…. 28

1.3. KỸ THUẬT RNAi TRONG TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG

VIRUS…………………………………………………………...…………….. 29

1.3.1. Các cơ chế RNAi ức chế gen ở thực vật……………........…………... 30

1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen

kháng virus………………………………………………………………….. 36

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................….. 40

2.1. VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.......... 40

2.1.1. Vật liệu thực vật……………………………………...........…………. 40

2.1.2. Vector và chủng vi khuẩn ……………………….........…………….... 42

2.1.3. Hóa chất và thiết bị ………………………………........……………... 42

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu……………………………….........…………… 42

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………….........………... 43

2.2.1. Nhóm các phƣơng pháp phân lập gen…………………...................... 43

2.2.2. Nhóm các phƣơng pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc

RNAi............................................................................................................................. 48

2.2.3. Phƣơng pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens............................. 52

2.3.4. Nhóm các phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen............................... 58

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…...................…. 60

3.1. TÁCH DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP CỦA

SMV………………………………………………...........……............................ 60

3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SMV.…… 60

3.1.2. Phân tích sự đa dạng của trình tự gen CP của các dòng SMV.............. 67

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

v

3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi ….. 74

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đơn loài

SMV…………………………………………………………...……………. 74

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng hai loài SMV

và BYMV…………………………………………………………………… 81

3.3. KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SMV

VÀ BYMV…………………………………………………..........………… 89

3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá…..... 89

……….......……………… 92

3.4. K RNAi …... 96

u t - ….... 96

các dòng cây đậu 0…………... 99

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………….......................…………….. 106

1. KẾT LUẬN……………………………………………........……………. 106

2. ĐỀ NGHỊ……………………………………………….......…………….. 107

................. 108

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………................................... 109

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

AS Acetosyrigone

BAP 6-benzyladenine purin

BGM Bean golden mosaic virus

bp Base pair )

BYMV Bean yellow mosaic virus

CCM Co-cultivation medium )

CAMV Cauliflower mosaic virus

CMV Cucumber mosaic virus

CP )

CPi –SMV Đoạn bảo thủ đƣợc thiết kế từ gen CP của SMV

CPi(SMV-BYMV) Đoạn bảo thủ đƣợc thiết kế từ gen CP của cả SMV và

BYMV

DNA Deoxyribo nucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

đtg Đồng tác giả

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

GA3 Gibberellic acid

GM Germination medium (môi trƣờng nảy mầm)

gus Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase

IAA Indoleacetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

kb Kilo base

LB Luria and Bertani

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

vii

MS Murashige & Skoog (1962) -Môi trƣờng cơ bản

NAA α-Naphthaleneacetic acid

nptII Neomycin phosphotransferase gene

OD Optical density – Mật độ quang

PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi Polymerase

PPT Phosphinothricin

PRSV Papaya ringspot virus

pK7GW-CPi-SMV: Vector chuyển gen mang cấu trúc CPi-SMV

pK7GW-CPi (SMV-BYMV) Vector chuyển gen mang cấu trúc CPi (SMV-

BYMV)

RM Rooting medium (môi trƣờng ra rễ)

RNAi RNA interference )

SDS Sodium dodecylsulfat

SEM Shoot elongation medium (môi trƣờng kéo dài chồi)

SIM Shoot induction medium (môi trƣờng tạo chồi)

SL1 SMV dòng Sơn La 1 - Việt Nam

SL2 SMV dòng Sơn La 2 - Việt Nam

SMV Soybean mosaic virus )

Taq Thermus aquaticus

T-DNA Vùng DNA plasmid chuyển vào thực vật

Ti- plasmid Plasmid tạo khối u

TMV Tobacco mosaic virus

TYLCV Tomato yellow leaf curl virus

v/p vòng/phút

Vir Virulence Region

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

YEP Yeast extract peptone

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

viii

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1.

2014............................................................... 6

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA.............................. 45

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR................................................ 46

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT……. 47

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector

pENTRTM/D-TOPO……………………………………. 50

Bảng 2.5. Thành phần phản ứng LR……………………………….. 51

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế………... 52

Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh in vitro………... 53

Bảng 2.8. Thành phần dung dịch đệm tách DNA tổng số…………. 58

Bảng 3.1. Trình tự cặp mồi PCR thiết kế sử dụng nhân bản đoạn

gen CP…………………………………………………… 60

Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự đoạn gen CP của SMV

dòng SL2 so với dòng SL1 và trình tự có mã số X63771.. 65

Bảng 3.3. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid của protein

suy diễn dòng SL2 so với dòng SL1 và trình tự có mã số

CAA45307………………………………………………. 66

Bảng 3.4.

Ngân hàng gen quốc tế

ng trong phân tích …………………………... 68

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

ix

Bảng 3.5.

………………….. 69

Bảng 3.6. Trình tự cặp mồi SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri …………… 76

Bảng 3.7. Trình tự cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri ………… 83

Bảng 3.8. Kết quả biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào mảnh

lá thuốc lá C9-1…………………………………………. 91

Bảng 3.9.

gen………………………….. 95

Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc -

2008 ……………………... 99

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

x

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Sơ đồ mô phỏng quá trình xâm nhiễm của SMV và

BYMV vào tế bào cây đậu tƣơng ……………………… 10

Hình 1.2. Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của

protease ………………………………………………… 12

Hình 1.3. Sơ đồ phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen………….. 21

Hình 1.4. Mô phỏng các con đƣờng làm câm gen thông qua RNAi. 31

Hình 1.5. Con đƣờng ức chế gen của siRNA và miRNA…………. 35

Hình 2.1. Hình ảnh các mẫu lá đậu tƣơng nghi nhiễm SMV và

BYMV thu thập từ một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam.. 40

2.2. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát……………………………... 44

Hình 2.3. Sơ đồ mô tả các bƣớc thiết kế vector mang cấu trúc

RNAi bằng kỹ thuật Gateway ………………………….. 49

Hình 2.4. giống

2008………………………………… 57

Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn

gen CP từ SMV ………………………………………… 61

Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc…. 62

Hình 3.3. So sánh trình tự đoạn gen CP

63771………………………………………………. 64

Hình 3.4. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein CP

SL1, SL2 45307………………………. 66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

xi

3.5. So sánh trình tự amino acid của vùng Poty-coat của

dòng SL1, SL2 và của protein có mã số CAA45307…… 67

3.6.

SMV đƣợc CP…….. 70

3.7. Sơ đồ hình cây đƣợc thiết lập dựa trên trình tự amino

acid suy diễn từ gen CP của SMV…………………….. 71

Hình 3.8. Trình tự đoạn CPi-SMV thiết kế từ vùng bảo thủ của

gen CP ở các loài SMV………………………………… 75

Hình 3.9.

của SMV………………………………………………... 76

Hình 3.10. Sơ đồ vị trí gắn đoạn CPi - SMV trong vector pENTRTM/D￾TOPO và vị trí gắn cặp mồi M13-F / M13-R……………. 77

Hình 3.11. -

13-F / M13-R……………………………….. 78

Hình 3.12. A: Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách plasmid tái tổ

hợp pEN-CPi-SMV; B: Sản phẩm PCR nhân đoạn CPi –

SMV từ pEN-CPi-SMV bằng cặp mồi SMV-CPi￾Fi/SMV-CPi-Ri………………………………………....

79

3.13. – -

- - - -

-

plasmid pK7GW-CPi-SMV …………………………....

80

3.14. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm cắt bằng Xba

Hind III…………………………………………………. 80

3.15. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR từ khuẩn lạc A.

tumefaciens……………………………………………… 81

Hình 3.16. Trình tự đoạn gen CPi (SMV-BYMV) thiết kế từ vùng

bảo thủ của SMV và BYMV………………………….... 82

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

xii

Hình 3.17. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen

CPi của SMV và BYMV……………………………...... 83

Hình 3.18. Sơ đồ vị trí gắn đoạn CPi (SMV-BYMV) trong vector

pENTRTM/D-TOPO và vị trí gắn cặp mồi SMV-CPi￾F/BYMV-CPi-R và cặp mồi M13-F/M13-R…………..... 84

3.19. Sơ đồ ghép nối và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm

colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) trong vector pEN￾CPi (SMV-BYMV)……………………………….............. 84

3.20. A: Kết quả điện di kiểm tra tách plasmid; B: Sản phẩm

PCR nhân đoạn CPi (SMV-BYMV) từ plasmid bằng cặp

mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri…………….. 85

Hình 3.21. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV￾BYMV) ………………………………………………… 86

Hình 3.22. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm cắt Vector pK7GW bằng

enzym Xba Hind III…………………………................ 87

Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn

lạc A. tumefaciens……………………………................. 89

Hình 3.24. CPi (SMV-BYMV)

vào cây thuốc lá C9-1…………………………………. 90

Hình 3.25.

………………………………... 92

Hình 3.26.

cây thuốc lá chuyển gen ………………………………... 93

Hình 3.27. cây

…………………... 94

Hình 3.28. Kết quả t

A. tumefaciens

…………………………………… 97

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

xiii

Hình 3.29. Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số của các dòng cây

đậu tƣơng chuyển gen giống ĐT12 (A) và giống

DT2008(B)……………………………………………… 100

Hình 3.30. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại cấu trúc CPi

(SMV-BYMV) từ

12……………………………………………... 100

Hình 3.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại cấu trúc CPi

(SMV-BYMV) từ

DT2008…………………………………………... 101