pcr (polymerase chain reaction)

Trêng ®¹i häc quèc gia

®¹i häc khoa häc tù nhiªn

khoa sinh häc

PCR

(Polymerase chain reaction)

(TiÓu luËn Sinh häc ph©n tö)

Sinh viªn: NguyÔn §øc Nhù

Líp K6-CNTNSH

Gi¶ng viªn híc dÉn:

PGS.TS

§ç Ngäc Liªn

1

Hµ néi, N¨m 2004

2

PCR

(Polymerase chain reaction)

I. Nh÷ng kiÕn thøc c¬ b¶n vÒ PCR.

PCR lµ tõ viÕt t¾t cña côm tõ Polymerase Chain Reaction trong tiÕng Anh.

Cã nhiÒu c¸ch dÞch cho côm tõ nµy. Cã s¸ch dÞch lµ ph¶n øng tæng hîp d©y

chuyÒn nhê Polymerase, cã tµi liÖu dÞch lµ ph¶n øng chuçi trïng hîp, hay ®¬n

gi¶n lµ kü thuËt PCR. ë ®©y chóng ta sÏ dïng ®¬n gi¶n lµ kü thuËt PCR.

Kü thuËt nµy do Kary Mullis vµ céng sù ph¸t minh vµo gi÷a thËp niªn 80

cña thÕ kû hai m¬i ®· ®a l¹i mét cuéc c¸ch m¹ng trong di truyÒn häc ph©n tö. Tõ

®ã ®Õn nay, nã ®· ®îc sö dông réng r·i vµ trë thµnh phÇn kh«ng thÓ thiÕu trong

c¸c hÇu hÕt c¸c phßng thÝ nghiÖm sinh häc ph©n tö.

Kary Mullis nhËn gi¶i thëng Nobel n¨m 1993 vÒ ph¸t minh PCR

Kary Mullis ®· viÕt trong t¹p chÝ khoa häc Mü: “ B¾t ®Çu b»ng mét ph©n tö

riªng lÎ cã chøa chÊt liÖu di truyÒn ADN, PCR cã thÓ t¹o ra 100 triÖu ph©n tö t-

¬ng tù trong mét buæi chiÒu. Ph¶n øng dÔ dµng thùc hiÖn. Nã ®ßi hái kh«ng

nhiÒu h¬n mét èng nghiÖm, mét vµi ho¸ chÊt ®¬n gi¶n vµ mét nguån nhiÖt. MÉu

ADN cÇn ®Ó nh©n b¶n cã thÓ tinh s¹ch, hoÆc lµ mét phÇn rÊt nhá trong mét hçn

hîp chÊt sinh häc cùc kú phøc t¹p. ADN cã thÓ tõ mÉu bÖnh phÈm cña bÖnh

viÖn, mét sîi tãc ngêi, mét giät m¸u r¬i ë hiÖn trêng ph¹m téi, hoÆc tõ m« n·o

3

x¸c íp, hay tõ mét wooly kh«ng lå 40.000 n¨m tuæi ®ãng b¨ng ë s«ng b¨ng ”

(Kary Mullis website.htm).

II. Môc ®Ých vµ ý nghÜa:

§èi tîng nghiªn cøu cña Sinh häc ph©n tö thêng lµ nh÷ng vËt chÊt di

truyÒn cã hµm lîng t¬ng ®èi nhá trong mÉu, hoÆc lµ nh÷ng gen ®¬n lÎ, rÊt nhá

trong mét hÖ gen phøc t¹p, khæng lå vÝ dô nh hÖ gen cña ®éng vËt bËc cao chøa

tíi 100.000 gen. Cã nhiÒu kü thuËt trong di truyÒn häc ph©n tö ®îc hoµn thiÖn ®Ó

vît qua khã kh¨n nµy, nhng chóng ®ßi hái nhiÒu thêi gian, cång kÒnh vµ rÊt khã

kh¨n trong viÖc t×m kiÕm nh÷ng ®o¹n and ®Æc hiÖu. Kü thuËt PCR cho phÐp

khuÕch ®¹i mét lîng ADN trong mÉu mét c¸ch nhanh chãng vµ rÎ tiÒn. Cßn ®èi

víi nh÷ng gen ®¬n lÎ, viÖc t¹o ra nhiÒu b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn lùa chän ®îc

thùc hiÖn mµ kh«ng cÇn t¸ch vµ nh©n dßng.

ADN ®îc khuÕch ®¹i cã thÓ xuÊt ph¸t tõ c¸c nguån rÊt kh¸c nhau, tõ c¸c

t¸c nh©n g©y bÖnh ë ngêi (HIV hay lµ bÖnh môn giép -herpes) ®Õn tinh dÞch

trong mét vô ¸n téi ¸c nµo ®ã hay ADN cña mét chó mèi sèng tõ 40 triÖu n¨m tr￾íc (Powledge 1998). Tr×nh tù ®Ých cã thÓ rÊt nhá (nh ®· nãi ë trªn) hay còng cã

thÓ rÊt lín (®Õn 104

cÆp baz¬) (Stryer 1995). YÕu tè mÊu chèt cña ADN khiÕn

PCR cã thÓ ®îc sö dông trong mäi trêng hîp lµ vËt liÖu di truyÒn.

Do nh÷ng u ®iÓm tuyÖt ®èi trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö, kü thuËt

PCR ®îc nhanh chãng ¸p dông réng r·i trong nhiÒu lÜnh vùc khoa häc vµ cho kÕt

qu¶ chÝnh x¸c. MÆt kh¸c sù ph©n tÝch thµnh phÇn vµ trËt tù nucleotide trªn ph©n

tö ADN trong hÖ gen cã gi¸ trÞ rÊt l¬n trong ph©n lo¹i c¸c loµi sinh vËt. ChÝnh

nhê tÝnh thùc tiÔn to lín ®ã mµ t¸c gi¶ cña PCR, Kary Mullis ®· ®îc tÆng gi¶i th￾ëng Nobel n¨m 1993.

III. C¬ së khoa häc (nguyªn lý) cña kü thuËt PCR:

PCR lµ mét ph¶n øng sinh ho¸ phô thuéc nhiÖt ®é, sö dông ®Æc ®iÓm cña

qu¸ tr×nh sao chÐp AND víi sù tham gia cña mét lo¹i enzyme AND polymerase

chÞu nhiÖt, cã hai ®o¹n ng¾n AND, mét sîi lµm måi (primers) vµ dïng c¸c ®o¹n

AND m¹ch ®¬n lµm khu«n ®Ó tæng hîp nªn sîi míi bæ sung víi nã. V× vËy khëi

®Çu qu¸ tr×nh tæng hîp AND cÇn cung cÊp ®o¹n måi oligonucleotide (cã ®é dµi

4

tõ 3-60 nucleotide). §o¹n nµy g¾n kÕt víi and khu«n t¹i ®iÓm khëi ®Çu sao

chÐp. §ã lµ ®Æc ®iÓm quan träng ®Çu tiªn cña PCR v× ADN polymerase ®îc ®iÒu

khiÓn ®Ó tæng hîp mét ®o¹n ADN ®Æc thï. Qu¸ tr×nh nµy ®îc enzyme adn

polymerase ®iÒu khiÓn ®Ó tæng hîp nªn mét sîi ADN®Æc thï. C¸c sîi ADN m¹ch

®¬n lµm khu«n ®îc t¹o ra theo c¸ch ®¬n gi¶n lµ n©ng nhiÖt ®é lªn trªn 90 ®é C

mµ thêng lµ 94 ®é C cho chuçi xo¾n kÐp ADN bung ra.

C¶ hai sîi ADN ®Òu ®îc dïng lµm khu«n cho qu¸ tr×nh tæng hîp nÕu c¸c

®o¹n måi (primer) ®îc cung cÊp ®Ó b¸m vµo vÞ trÝ t¬ng øng cho c¶ hai sîi. Trong

kü thuËt PCR, c¸c ®o¹n måi ®îc chän n»m ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n lªn sao

cho c¸c sîi ADN tæng hîp míi ®îc b¾t ®Çu t¹i mçi ®o¹n måi vµ kÐo dµi vÒ phÝa

®o¹n måi n»m trªn sîi kia, cho s¶n phÈm cã ®é dµi n»m gi÷a hai ®o¹n måi nµy.

§é dµi cña s¶n phÈm PCR cã thÓ tõ vµi tr¨m ®Õn hµng ngµn, thËm chÝ hµng chôc

ngµn cÆp nucleotide. Nh vËy, sau mçi chu kú, c¸c ®iÓm b¸m cho c¸c ®o¹n måi l¹i

xuÊt hiÖn cho mçi ADN míi ®îc tæng hîp . Hçn hîp ph¶n øng l¹i ®îc n©ng nhiÖt

®é lªn thÝch hîp sao cho c¸c sîi ban ®Çu t¸ch khái sîi míi tæng hîp, c¸c sîi nµy

sau ®ã ®îc dïng lµm khu«n cho chu kú tiÕp theo, bao gåm c¸c bíc: g¾n måi,

tæng hîp ADN vµ t¸ch rêi c¸c ®o¹n.

KÕt qu¶ cuèi cïng cña ph¶n øng PCR lµ sau n chu kú cña ph¶n øng, tÝnh

theo lý thuyÕt ta sÏ cã 2n b¶n sao c¸c ph©n tö ADN m¹ch kÐp n»m gi÷a hai ®o¹n

måi. §ã lµ ®Æc ®iÓm quan träng thø hai cña kü thuËt PCR. Nh vËy kÕt qu¶ lµ mét

®o¹n ADN ®Þnh tríc ®îc nh©n lªn víi mét lîng rÊt lín, vÝ dô sau 32 chu kú sè l￾îng b¶n sao ADN cña PCR sÏ lµ 1.073.741.824.

5