Nhận Dạng Và Đánh Giá Mức Độ Đa Dạng Di Truyền Loài Râu Hùm Tacca Chantrieri André Ở Vqg Ba Vì Bằng Kỹ Thuật Sinh Học Phân Tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

TRỊNH THỊ THÙY LINH

NHẬN DẠNG VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN LOÀI RÂU HÙM (Tacca chantrieri André)

Ở VQG BA VÌ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. VŨ ĐÌNH DUY

2. TS. HÀ BÍCH HỒNG

Hà Nội, 2022

i

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài nghiên cứu của tôi về “Nhận dạng và đánh giá mức độ đa

dạng di truyền loài Râu hùm (Tacca chantrieri André) ở VQG Ba Vì

bằng kỹ thuật sinh học phân tử”. Đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi

dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Vũ Đình Duy và TS. Hà Bích Hồng. Các

số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố

trong bất kì công trình nào khác. Nếu nội dung nghiên cứu của tôi không

trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn

chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa

học.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Người cam đoan

Trịnh Thị Thùy Linh

ii

LỜI CẢM ƠN

Đề tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện

Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ sinh

học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn

chân thành tới Ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện để các công việc chuyên

môn của đề tài được tiến hành thuận lợi.

Khi thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ nhiệt

tình của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp. Sự ủng hộ về mặt tinh thần và

những chỉ dẫn, góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu vô cùng quý báu này khiến

tôi thực sự cảm kích, biết ơn.

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Đình Duy và

TS. Hà Bích Hồng, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn

thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh

nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm

Nhiệt đới Việt - Nga và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại

học Lâm nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ của cơ sở đào tạo sau Đại học

trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt

khóa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô làm việc và giảng

dạy tại khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá

trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã

luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn.

Đề tài được hỗ trợ bởi đề tài cấp cơ sở (2021-2022) của viện Sinh thái

Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga. Chủ nhiệm TS. Vũ Đình Duy.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Học viên

Trịnh Thị Thùy Linh

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ..............................................................................................i

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii

MỤC LỤC........................................................................................................iii

DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v

DANH MỤC CÁC HÌNH................................................................................vi

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT.................................................................................vii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Chương 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................... 4

1.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và hiện trạng phân bố các loài thuộc chi

Râu hùm (Tacca)............................................................................................ 4

1.2. Mã vạch ADN và ứng dụng trong định loại các loài trong chi Râu hùm7

1.3. Một số chỉ thị phân tử dùng trong phân tích đa dạng di truyền quần thể

và loài thực vật............................................................................................. 11

1.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền loài trong chi Râu hùm......................... 15

Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 16

2.1. Nội dung nghiên cứu............................................................................. 16

2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................... 16

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: Loài Râu hùm hiện đang phân bố tự nhiên

tại VQG Ba Vì, Hà Nội........................................................................... 16

2.2.2. Địa điểm nghiên cứu..................................................................... 16

2.2.3. Hóa chất, trang thiết bị và dụng cụ trong nghiên cứu.................. 17

2.2.4. Phương pháp điều tra ngoại nghiệp ............................................. 17

2.2.5. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ............................................. 17

2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 20

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................ 22

3.1. Xác định trình tự nucleotide vùng gen lục lạp (matK) và gen nhân (ITS-

iv

rDNA) và khả năng nhận diện loài Râu hùm ở VQG Ba Vì........................ 22

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số và tinh sạch ADN từ 30 mẫu mô (lá) loài

Râu hùm. ................................................................................................. 22

3.1.2. Nhân vùng gen nhân (ITS) và vùng gen lục lạp (matK) bằng kỹ

thuật PCR cho loài Râu hùm ở VQG Ba Vì. ........................................... 24

3.1.3. Trình tự nucleotide hai vùng gen (ITS và matK) của loài Râu hùm

ở VQG Ba Vì........................................................................................... 27

3.1.4. Đặc điểm ADN của loài Râu hùm ở VQG Ba Vì dựa trên trình tự

nucleotide một số vùng gen ITS-rDNA và matK...................................... 28

3.2. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền loài Râu hùm ở VQG Ba Vì bằng

chỉ thị phân tử ISSR..................................................................................... 36

3.2.1. Thực hiện phản ứng PCR-ISSR cho loài Râu hùm ở VQG Ba Vì .... 36

3.2.2. Xác định mức độ đa dạng di truyền cho loài Râu hùm ở VQG Ba

Vì ............................................................................................................. 37

3.2.3. Xác định hệ số tương đồng di truyền và khoảng cách di truyền

giữa các cá thể Râu hùm ở VQG Ba Vì .................................................. 40

3.2.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại giữa các cá thể Râu hùm ở VQG Ba

Vì.............................................................................................................. 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 44

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ……………………………………………45

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 45

PHỤ LỤC

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự và thông tin về các cặp mồi trong nghiên cứu.................. 18

Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 20 chỉ thị ISSR sử dụng trong nghiên cứu .... 19

Bảng 3.1. Giá trị OD và hàm lượng ADN của 30 mẫu Râu hùm. .................. 23

Bảng 3.2. Thành phần nucleotide của loài Râu hùm dựa trên trình tự ITS .... 29

Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong nghiên cứu và 14 loài

cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích vùng gen ITS....................... 30

Bảng 3.4. Thành phần nucleotide của loài Râu hùm dựa trên trình tự matK . 32

Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong nghiên cứu và 15 loài

cùng chi lấy trên Genbank trên cơ sở phân tích vùng gen matK .................... 33

Bảng 3.6. So sánh khả năng phân biệt các loài Tacca dựa trên vùng gen ITS

và matK ........................................................................................................... 35

Bảng 3.7. Giá trị PIC, tỷ lệ phân đoạn DNA đa hình của loài Râu hùm phân

tích với 15 chỉ thị ISSR................................................................................... 38

Bảng 3.8 Thông số đa dạng di truyền quần thể Râu hùm phân tích với 15 chỉ

thị phân tử ISSR.............................................................................................. 40

Bảng 3.9. Bảng hệ số tương đồng của 30 mẫu Râu hùm nghiên cứu............. 41

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Đa dạng về đặc điểm sinh sản giữa các loài Tacca (Zhang et al., 2011)..... 6

Hình 3.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số 30 mẫu lá loài Râu hùm trên gel

agarose 1% ...................................................................................................... 22

Hình 3.2. Kiểm tra DNA tổng số sau khi tinh sạch đại diện cho 30 mẫu Râu

hùm trên gel agarose 1%................................................................................. 22

Hình 3.3. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR đoạn gen ITS trên gel

Agarose 1,5% (M: DNA ladder; 1-30: thứ tự mẫu Râu hùm) ........................ 25

Hình 3.4. Sơ đồ đại điện các peak trong giải trình tự vùng gen ITS-rDNA của

30 mẫu Râu hùm. ............................................................................................ 26

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra điện di sản phẩm PCR đoạn gen matK trên gel

Agarose 1,5% (M: DNA ladder; 1-30: thứ tự mẫu Râu hùm) ........................ 26

Hình 3.6. Sơ đồ đại điện các peak trong giải trình tự vùng gen matK của 30

mẫu Tacca sp................................................................................................... 27

Hình 3.7. Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu với các loài trong cùng

chi trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS) bằng phương

pháp ML. Các số trên các nhánh là giá trị bootstrap. ..................................... 31

Hình 3.8. Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu với các loài trong cùng

chi trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen lục lạp (matK) bằng

phương pháp ML. Các số trên các nhánh là giá trị bootstrap. ........................ 34

Hình 3.9. Hình ảnh điện di cặp mồi ISSR đa hình trên gel agarose 1,5% (số 1-

30 là ký hiệu mẫu; M- thang ADN ladder)..................................................... 37

Hình 3.10. Mối quan hệ di truyền của 30 mẫu Râu hùm ở VQG Ba Vì......... 43

Hình 3.11. Tọa độ không gian chính (PCoA) của 30 mẫu Râu hùm ở VQG Ba

Vì..................................................................................................................... 43

vii

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleit (Deoxyribonucleic acid)

bp Cặp bazơ (base pair)

CR Loài cực kỳ nguy cấp

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

Genbank Ngân hàng gen quốc tế

NCBI Trung tâm thông tin công nghệ sinh học quốc gia (National

Center for Biotechnology Information)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)

ISSR

UV Ánh sáng tử ngoại

VU Loài sẽ nguy cấp

Quần thể

BV VQG Ba Vì, Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Thống kê từ Danh lục cây một lá mầm của thế giới cho thấy Chi Râu

hùm (Tacca, họ Râu hùm Taccaceae) có 19 loài trên thế giới

(http://apps.kew.org/wcsp/home.do). Ở Việt Nam, có 7 loài: Râu hùm (Tacca

chantrieri), Ngải rợm (T. integrifolia), Râu hùm lá chân vịt (T. palmata), Củ

nưa (T. leontopetaloides), Hồi đầu (T. plantaginea), Râu hùm lớn (T.

subflabellata) và Râu hùm khánh hòa (T. khanhhoaensis), phân bố ở nơi đất

ẩm ven suối tầng dưới tán rừng nhiệt đới ẩm. Trong số đó, 2 loài Râu hùm lớn

và Ngải rợm là nguồn dược liệu quan trọng và được xếp vào bậc sẽ nguy cấp

(VU A1a,c,d). Lá cây loài Râu hùm lớn có thể sử dụng làm rau ăn, củ chứa

hàm lượng diosgenin tương đối cao, là nguyên liệu bán tổng hợp các loại

thuốc Corticoid (Võ Văn Chi, 2012). Loài Ngải rợm cũng được dân gian sử

dụng làm thuốc chữa một số bệnh như viêm dạ dày và hành tá tràng, sưng đau

vòm họng; dùng ngoài để trị mụn nhọt lở ngứa (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2018).

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy, các hợp chất taccasuboside A-D,

taccasuboside C và taccaoside D được phân lập từ loài Râu hùm lớn đã được

đánh giá tác dụng gây ức chế trên 5 dòng tế bào ung thư HL-60 (ung thư máu),

SMMC-7721 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú), và

SW480 (ung thư đại tràng) (Yokosuka et al., 2004; Li et al., 2011). Một số

nghiên cứu trước đây đã cung cấp dữ liệu ban đầu liên quan đến phân bố, hình

thái, phân loại và đặc điểm sinh thái học một số loài thuộc chi này. Ở Việt

Nam hiện nay có 8 công trình công bố liên quan đến thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của 3 loài Râu hùm, Râu hùm lớn và Hồi đầu (Vũ Thị

Quỳnh Chi và cs, 2015ab,c, 2016a,b; Pham Hai Yen et al., 2016a,b); chưa có

công trình công bố theo hướng di truyền phân tử của các loài trong chi Râu

hùm. Các nghiên cứu vẫn chưa cung cấp đầy đủ dữ liệu về: đặc điểm vật hậu;

tuyển chọn các xuất xứ và khảo nghiệm các loài này ở các vùng sinh thái khác