Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện bệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) trên đa dạng nền mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR :Luận văn thạc sĩ :Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

BỘ CÔNG THƢƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN VIỆT QUỐC

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

PHÁT HIỆN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI

(ASF) TRÊN ĐA DẠNG NỀN MẪU SỬ DỤNG

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã ngành: 8420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

Công trình đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Công nghiệp TP. Hồ Chí Minh.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS.BS. Phạm Hùng Vân

Luận v n thạc s đƣợc ảo vệ tại Hội đồng ch m ảo vệ Luận v n thạc s Trƣờng

Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày16 tháng 6 n m 2022

Thành phần Hội đồng đánh giá luận v n thạc s gồm:

1. TS. Nguyễn Thị Kim Anh - Chủ tịch Hội đồng

2. TS. Lao Đức Thuận - Phản iện 1

3. TS. Trần Thị Huyền - Phản iện 2

4. TS. Trần Quỳnh Hoa - Ủy viên

5. TS. Mai Bích Dung - Thƣ ký

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG VIỆN TRƢỞNG VIỆN CNSH&TP

TS. NGUYỄN THỊ KIM ANH

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN VIỆT QUỐC MSHV: 19000191

Ngày, tháng, n m sinh: 18/03/1982 Nơi sinh: Trà Vinh

Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 8420201

I. TÊN ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) trên đa

dạng nền mẫu sử dụng kỹ thuật real-time PCR

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Xác định tên đề tài

- Xây dựng phƣơng pháp nghiên cứu

- Thu thập mẫu nghiên cứu

- Xây dựng và hoàn thiện quy trình phát hiện ASFV ằng kỹ thuật real-time PCR

 Kiểm tra các thiết kế primer – pro e đƣợc OIE khuyến cáo in silico

 Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e phát hiện ASFV

 Tổng hợp hoá học trình tự primer – pro e cho chứng nội tại ổ sung vào phản

ứng real-time PCR.

 Thẩm định các thông số kỹ thuật của ộ sinh phẩm

- Xác định tỷ lệ lƣu hành của ệnh

 Xử lý mẫu tiền ly trích

 Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử

 Thực hiện phản ứng real – time PCR phát hiện ASFV

 Thống kê tỷ lệ dƣơng tính

- Xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu môi trƣờng, ề mặt

 Xử lý mẫu tiền ly trích

 Thu nhận DNA tổng số từ mẫu thử

 Thực hiện phản ứng real – time PCR phát hiện ASFV

BỘ CÔNG THƢƠNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

 Thống kê tỷ lệ dƣơng tính trên các yếu tố nguy cơ và môi trƣờng ch n nuôi.

- Xác định genotype ASFV

 Khuếch đại trình tự 478 p trên vùng ảo tồn của gen mã hoá VP72

 Giải trình tự gen ảo tồn đƣợc khuếch đại

- Xây dựng phƣơng pháp kiểm soát yếu tố nguy cơ để phòng, chống ệnh ASF.

II. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 29/9/2021

III. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 16/6/2022

IV. NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 6 năm 2022

NGƢỜI HƢỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

VIỆN TRƢỞNG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

(Họ tên và chữ ký)

i

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Hùng Vân đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều

kiện thuận lợi, giúp đỡ con trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô trong Viện công nghệ Sinh học và Thực phẩm -

Trƣờng Đại học Công nghiệp TP. HCM đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về

chuyên ngành trong suốt thời gian học tập và quá trình làm luận v n thạc s .

Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Nam Khoa đã hỗ trợ kinh phí và tạo mọi điều

kiện thuận để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài.

Đồng cảm ơn t t cả anh chị phòng Kiểm tra Ch t lƣợng, phòng RD và phòng Sinh

học Phân tử Công ty TNHH Dịch vụ và Thƣơng mại Nam Khoa đã giúp đỡ tôi

trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, vợ và con gái của tôi vì đã luôn hỗ

trợ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Thành tựu này sẽ

không thể có đƣợc nếu không có họ.

Xin chân thành cảm ơn!

ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Dịch tả lợn Châu Phi (ASF) là ệnh dịch gây chết gần nhƣ hoàn toàn lợn ị nhiễm.

Cho đến nay vẫn chƣa có vắc xin và thuốc điều trị đặc hiệu, trong khi các ác s thú

y chƣa thể phân iệt chính xác ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) với ệnh dịch tả

lợn cổ điển (CSF) thông qua th m khám các iểu hiện lâm sàng và mổ tử thi. Chính

vì vậy, việc phát triển ộ xét nghiệm sử dụng kỹ thuật real-time PCR phát hiện sớm

ệnh đƣợc xem là công cụ chính hỗ trợ trong nhiệm vụ phòng chống dịch của quốc

gia. Trong nghiên cứu này, ộ xét nghiệm sử dụng cặp mồi khuếch đại vùng gen

VP72 của ASFV đƣợc khuyến cáo ởi OIE, đồng thời sử dụng cặp mồi khuếch đại

vùng gen đặc hiệu của vi rút gây ệnh đốm trắng làm chứng nội tại. Kết quả đánh

giá các thông số kỹ thuật thu đƣợc có độ nhạy là 1.854 ản sao/ phản ứng (95%CI:

1.073 – 3.205), độ đặc hiệu 100%, độ lặp lại và độ tái lập r t tốt với CV ≤ 10%, và

có khả n ng chống ức chế. Tỷ lệ lƣu hành của ASF trên 7713 mẫu chiếm 7.47%

(538/6665 mẫu ệnh phẩm dƣơng tính với ASFV chiếm 8,07% và 38/1048 mẫu môi

trƣờng ch n nuôi để xác định các yếu tố nguy cơ có tỷ lệ nhiễm là 3,63%). Trong đó

khi phân tích so sánh tỷ lệ lƣu hành ệnh trên các mẫu nhƣ máu, nội tạng hoặc dịch

cơ thể trực tiếp từ lợn cho th y tỷ lệ nhiễm ASFV ở trại có quy mô vừa và nhỏ lên

đến 23.93%, còn trại lớn là 6.41%. Tƣơng tự, khi xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm

trên nền mẫu quệt môi trƣờng, quệt nền chuồng, ề mặt chuồng, đ t, nƣớc sinh hoạt

và nƣớc thải ghi nhận tỷ lệ phát hiện ASFV ở trại vừa và nhỏ chiếm 7.37% nhƣng ở

trại lớn chỉ là 1.69%. Mặt khác khi phân tích trình tự của 13 mẫu dƣơng tính với

ASFV cho th y t t cả đều thuộc genotype II. Tóm lại, đã xây dựng và ứng dụng

thành công ộ xét nghiệm real-time PCR để phát hiện ASFV (NK ASFVquant PCR

kit) trên các đối tƣợng mẫu thử khác nhau tại phòng xét nghiệm. Tuy nhiên để đƣợc

sử dụng rộng rải thì ộ xét nghiệm này cần đƣợc khảo nghiệm ởi một đơn vị có

thẩm quyền và đƣợc c p phép lƣu hành ởi Cục Thú Y.

iii

ABSTRACT

African Swine Fever (ASF) is a high mortality rate epidemic, which leads to severe

economic damage and a lack of worldwide food supplies. No vaccine or drug is

available to treat ASF. Additionally, veterinarians have not been able to distinguish

African Swine Fever (ASF) from Classical Swine Fever (CSF) based solely on

clinical manifestations and necropsies. Hence, real-time PCR tests could be an

important tool for supporting the country's disease prevention. A real-time PCR

reaction was conducted in this study using the OIE-recommended primer pair to

amplify the VP72 gene while the White Spot Syndrome Virus specific primer was

used as an internal control. The obtained parameters indicate that the sensitivity is

1,854 copies per reaction (95%CI: 1,073 - 3,205), the specificity is 100%,

repeatability is good, and reproducibility is with a coefficient of variation of 10%;

PCR inhibition was avoided. Infection rates of ASFs were observed on 7713

samples for 7.47% (538/6665 ASF positive samples represented 8.07% and 38/1048

farm-related samples demonstrated a 3.63% infection rate). Furthermore, a positive

rate of specimens (related to body fluids or organs) collected from small and

average farms equals 23.93%, while that of large farms is 6.41%. We also measured

the risk of infection from the environment by sampling the cage floor, cage surface,

soil, and domestic water and wastewater. ASFV accounted for 7.37% of small and

medium-sized farms, and 1.69% of large farms. We also sequenced 13 positive

samples of ASFV using DNA sequencing and found that all these samples belonged

to genotype II strains. As a result, a real-time PCR kit has been developed to detect

ASFV (NK ASFV quant PCR kit) on various specimens received in the laboratory.

It is important, though, that this test kit be tested by a competent unit before it can

be widely used. It also needs to be licensed by the Department of Veterinary

Medicine to circulate.

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận v n tốt nghiệp: ―NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH

PHÁT BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI (ASF) TRÊN ĐA DẠNG NỀN MẪU

SỬ DỤNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR‖ là công trình nghiên cứu của ản thân

tôi. Việc tham khảo các nguồn tài liệu trong luận v n đã đƣợc nêu rõ trong phần tài

liệu tham khảo và đã đƣợc thực hiện trích dẫn đúng quy định. Các số liệu, kết quả

trình ày trong luận v n là hoàn toàn trung thực, không sao chép từ t kỳ một

nguồn nào và dƣới t kỳ hình thức nào.

Học viên

(Chữ ký)

Nguyễn Việt Quốc

v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ............................................................................ ii

ABSTRACT.............................................................................................................. iii

LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv

MỤC LỤC...................................................................................................................v

DANH MỤC HÌNH ẢNH ..........................................................................................x

DANH MỤC BẢNG BIỂU ..................................................................................... xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.................................................................................. xiv

MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1

1. Đặt v n đề ...............................................................................................................1

2. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................................2

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu...........................................................................2

4. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................3

5. Ý ngh a thực tiễn của đề tài.....................................................................................4

CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................5

1.1 African Swine Fever Virus (ASFV)..............................................................5

1.1.1 Phân loài ASFV.............................................................................................5

1.1.2 C u trúc ASFV ..............................................................................................6

1.1.2.1 Hình thể và cấu trúc phân tử của ASFV ....................................................6

1.1.2.2 Cấu trúc hệ gen của ASFV.........................................................................7

1.1.3 Quá trình xâm nhiễm của ASFV .................................................................10

1.2 Các con đƣờng lây nhiễm của ASFV ..........................................................13

1.2.1 Chu trình lây nhiễm hoang dại ....................................................................13

1.2.2 Chu trình lây nhiễm ve – lợn .......................................................................14

1.2.3 Chu trình lây nhiễm lợn nuôi.......................................................................15

1.2.4 Khả n ng tồn tại của vi rút ASF ..................................................................15

1.3 Diễn iến lâm sàng của ệnh ASF ..............................................................17

vi

1.3.1 Quá c p ........................................................................................................18

1.3.2 C p tính........................................................................................................18

1.3.3 Á c p............................................................................................................19

1.3.4 Mãn tính.......................................................................................................20

1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán cận lâm sàng hiện có .............................................20

1.4.1 Phát hiện vi rút.............................................................................................20

1.4.1.1 Phát hiện hệ gen ASFV bằng phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)............20

1.4.1.2 Phân lập vi rút..........................................................................................23

1.4.1.3 Phát hiện kháng nguyên ASF bằng thử nghiệm kháng thể phát quang trực

tiếp (FAT – Direct fluorescent antibody test) ...........................................................24

1.4.1.4 Phát hiện kháng nguyên bằng thử nghiệm ELISA kháng nguyên ............24

1.4.2 Phát hiện kháng thể ASF .............................................................................25

1.4.2.1 Phát hiện kháng thể bằng thử nghiệm ELISA ..........................................25

1.4.2.2 Phát hiện kháng thể ASF bằng thử nghiệm kháng thể phát quanh gián

tiếp (IFA – indirect fluorescent antibody test)..........................................................26

1.4.2.3 Phát hiện kháng thể bằng thử nghiệm hoá mô miễn dịch xúc tác

peroxidase (IPT – indirect immunoperoxidase test).................................................27

1.5 Kiểm soát và phòng chống ệnh ASF .........................................................27

1.6 Vắc xin.........................................................................................................28

1.7 Tình hình nghiên cứu...................................................................................29

1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc................................................................29

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ................................................................31

CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................32

2.1 Vật liệu nghiên cứu......................................................................................32

2.1.1 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...............................................................32

2.1.2 Hoá ch t.......................................................................................................32

2.1.2.1 Hoá chất xử lý tiền ly trích.......................................................................32

2.1.2.2 Hoá chất tách chiết DNA tổng số.............................................................33

2.1.2.3 Hoá chất thực hiện phản ứng PCR ..........................................................33

2.1.2.4 Hoá chất khuếch đại trình tự gen VP72 của ASFV..................................34

2.1.2.5 Hoá chất điện di .......................................................................................34

vii

2.1.2.6 Hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR ..........................................................34

2.1.2.7 Hóa chất sử dụng cho PCR Sequencing mix............................................34

2.1.2.8 Hóa chất sử dụng tinh sạch và hòa tan sản phẩm PCR Sequencing .......35

2.1.3 Thiết ị và vật tƣ tiêu hao............................................................................35

2.1.3.1 Thiết bị......................................................................................................35

2.1.3.2 Vật tư tiêu hao ..........................................................................................36

2.2 Phƣơng pháp xây dựng ộ xét nghiệm real-time PCR phát hiện ASFV.....36

2.2.1 Primer và Taqman probe .............................................................................36

2.2.2 Xây dựng các thành phần ộ xét nghiệm real-time PCR phát hiện ASFV .37

2.2.3 Phƣơng pháp xây dựng ASF TQPCR master mix.......................................37

2.2.4 Phƣơng pháp xây dựng chứng dƣơng và chứng chuẩn ...............................39

2.2.4.1 Phương pháp xây dựng chứng dương ASFV............................................39

2.2.4.2 Phương pháp xây dựng chứng chuẩn.......................................................39

2.2.4.3 Chứng nội tại............................................................................................40

2.2.4.4 Chứng âm .................................................................................................41

2.3 Phƣơng pháp đánh giá thông số kỹ thuật của ộ xét nghiệm real-time PCR

trong phòng thí nghiệm.............................................................................................41

2.3.1 Các thông số kỹ thuật cần đánh giá trong phòng thí nghiệm ......................41

2.3.2 Phƣơng pháp đánh giá các thông số kỹ thuật trong phòng thí nghiệm .......41

2.3.2.1 Giới hạn phát hiện (LOD)........................................................................41

2.3.2.2 Độ chính xác.............................................................................................42

2.3.2.3 Độ đặc hiệu phân tích (SP)......................................................................43

2.3.2.4 Khả năng chống ức chế............................................................................44

2.3.2.5 Độ ổn định sử dụng ..................................................................................44

2.4 Phƣơng pháp thực hiện real-time PCR phát hiện ASFV trên mẫu thật.......45

2.4.1 Thu nhận mẫu ..............................................................................................45

2.4.2 Quy trình thực hiện......................................................................................46

2.4.2.1 Mẫu...........................................................................................................47

2.4.2.2 Xử lý mẫu .................................................................................................47

2.4.2.3 Quy trình tách chiết DNA tổng số............................................................48

2.4.2.4 Thực hiện real-time PCR phát hiện tác nhân ASFV ................................50

viii

2.4.2.5 Đọc và phân tích kết quả real-time PCR phát hiện tác nhân ASFV........51

2.5 Phƣơng pháp giải trình tự 13 mẫu dƣơng tính với ASFV ...........................52

2.5.1 PCR khuếch đại phân đoạn gen mã hoá protein p72...................................52

2.5.2 Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại ........................................................53

2.5.3 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại...................................................................54

2.5.4 Thực hiện phản ứng PCR sequencing .........................................................55

2.5.5 Tinh sạch sản phẩm PCR sequencing..........................................................56

2.5.6 Chạy điện di mao quản trên máy ABI 3130XL...........................................57

2.5.7 Xác định genotype của ASFV dựa trên vùng ảo tồn của gen mã hoá p72 57

2.6 Thống kê và phân tích số liệu......................................................................58

CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.........................................................59

3.1 Kết quả xây dựng các thành phần của ộ xét nghiệm phát hiện DNA của

ASFV .....................................................................................................................59

3.1.1 Kết quả xây dựng chứng dƣơng ..................................................................59

3.1.2 Kết quả xây dựng chứng nội tại...................................................................59

3.1.3 Kết quả đánh giá khả n ng hoạt động của ASFV TQPCR master mix.......60

3.1.4 Kết quả đánh giá khả n ng cạnh tranh của chứng nội tại với DNA mẫu thử..

.....................................................................................................................61

3.2 Kết quả đánh giá các thông số kỹ thuật của ộ xét nghiệm phát hiện ASFV

trong phòng thí nghiệm.............................................................................................62

3.2.1 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện (LOD).................................................62

3.2.2 Kết quả khảo sát độ chính xác .....................................................................63

3.2.2.1 Độ lặp lại..................................................................................................63

3.2.2.2 Độ tái lập..................................................................................................64

3.2.3 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu.......................................................................65

3.2.4 Kết quả khảo sát khả n ng chống ức chế ....................................................66

3.2.5 Kết quả khảo sát độ ổn định sử dụng...........................................................67

3.3 Kết quả thực hiện xét nghiệm real-time PCR phát hiện ASFV trên các loại

mẫu thật.....................................................................................................................70

3.3.1 Xác định tỷ lệ lƣu hành của ệnh dịch tả lợn Châu Phi (ASF) ...................70

ix

3.3.2 Xác định tỷ lệ lƣu hành của ệnh ASF trong khu vực trên đối tƣợng là các

mẫu ệnh phẩm trực tiếp từ lợn ................................................................................71

3.3.3 Xác định yếu tố nguy cơ lây nhiễm trên nền mẫu môi trƣờng, ề mặt .......72

3.3.4 Yếu tố nguy cơ giữa các trại quy mô khác nhau .........................................75

3.3.5 Các yếu tố nguy cơ khác..............................................................................75

3.3.6 Kết quả xác định genotype lƣu hành ...........................................................77

3.4 Xây dựng quy trình an toàn sinh học kiểm soát yếu tố nguy cơ .................79

3.5 Hoàn thiện quy trình phát hiện ASFV ằng kỹ thuật real-time PCR..........80

3.5.1 Mục đích sử dụng ........................................................................................80

3.5.2 Tên, thành phần và thông số kỹ thuật ộ thử nghiệm .................................80

3.5.3 Kiểm soát ch t lƣợng...................................................................................81

3.5.4 Trang thiết ị ...............................................................................................81

3.5.5 Lƣu trữ.........................................................................................................82

3.5.6 Cảnh áo và đề phòng .................................................................................82

3.5.7 Nguyên tắc hoạt động ..................................................................................83

3.5.8 Phƣơng pháp tiến hành ................................................................................83

3.5.8.1 Mẫu thử ....................................................................................................83

3.5.8.2 Phương pháp ............................................................................................84

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................87

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA HỌC VIÊN ............................89

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................91

PHỤ LỤC..................................................................................................................98

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN .......................................................125

x

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 C u trúc tổng thể ASFV. A, ảnh chụp cryo của phân tử vi rút. B, hình ảnh

giả lập ề mặt vi rút. C, hình ảnh giả lập cắt lớp nửa dƣới vi rút cùng mô

phỏng tái tạo ảng đồ 3D các thành phần c u trúc. D, giản đồ vị trí sắp

xếp các lớp của vi rút ASFV [8].................................................................7

Hình 1.2 Tổ chức hệ gen của ASFV. Sự sắp xếp các ORF trên hệ gen đƣợc mô tả

theo chủng phân lập Georgia 2007/1 [16]..................................................9

Hình 1.3 Quá trình xâm nhập và nhân lên của ASFV trong tế ào [7].....................12

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả a chu trình lây nhiễm ASFV ................................................14

Hình 1.5 Một số thể lâm sàng của ASFV dựa trên tải lƣợng vi rút ..........................18

Hình 2.1 Thiết ị tách chiết DNA/RNA tự động KingFisher Flex...........................49

Hình 2.2 Nguyên tắc hoạt động quy trình tách chiết sử dụng công nghệ nano từ trên

thiết ị KingFisher Flex............................................................................49

Hình 3.1 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ đƣờng chuẩn dãy pha loãng chứng dƣơng

ASFV có nồng độ từ 100

đến 108

ản sao/ phản ứng. ..............................59

Hình 3.2 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ đƣờng chuẩn của chứng nội tại ở 6 nồng độ

plasmid pha loãng từ 100

đến 105

ản sao/ phản ứng...............................60

Hình 3.3 (A) Biểu đồ ên trái khuếch đại dãy chứng dƣơng ASFV pha loãng có

(màu đỏ) và không có (màu xanh) ổ sung 20µl chứng nội tại trƣớc khi

tách chiết DNA khi đọc ở kênh màu Fam. (B) Biểu đồ ên phải khuếch

đại của dãy chứng dƣơng ASFV pha loãng có ổ sung 20µl chứng nội tại

trƣớc khi tách chiết DNA khi đọc ở kênh màu Hex.................................61

Hình 3.4 (A) Biểu đồ ên trái khuếch đại các mẫu chứng dƣơng có nồng độ 1 ản

sao (màu đỏ) và 5 ản sao trong 200µl huyết thanh lợn (màu xanh), mỗi

nồng độ đƣợc lặp lại 20 lần. (B) Biểu đồ ên trái khuếch đại các mẫu

chứng dƣơng có nồng độ 25 ản sao (màu đỏ) và 50 ản sao trong 200µl

huyết thanh lợn (màu xanh), mỗi nồng độ đƣợc lặp lại 20 lần.................62

Hình 3.5 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn 3 dãy chứng dƣơng có nồng độ 100

đến 107 ản trong 200µl huyết thanh lợn.................................................63

Hình 3.6 Biểu đồ khuếch đại và iểu đồ chuẩn dãy chứng dƣơng có nồng độ 100

đến 107

ản trong 200µl huyết thanh lợn đƣợc khảo sát trong ngày 1.....64