Nghiên cứu và thu nhận enzym protease từ các chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐

Trần Thị Nhã Uyên

NGHIÊN CỨU VÀ THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ CÁC

CHỦNG NẤM SỢI Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT.

Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. TRẦN THANH THỦY

TP. Hồ Chí Minh , tháng 7 – năm 2010

MỞ ĐẦU

Lí do chọn đề tài.

Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản

của sinh vật mà còn có vai trò rất lớn trong công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, kĩ thuật phân

tích, công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Do có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

mà ngành công nghiệp enzyme đã đem lại lợi nhuận to lớn cho nhiều nước. Ở Việt Nam, ngành

công nghệ enzyme vẫn chưa thật sự phát triển. Mỗi năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn các

enzyme để ứng dụng vào sản xuất công, nông nghiệp, giải quyết ô nhiễm MT…

Trong các loại enzyme, protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất. Năm 1995, tổng doanh

thu từ enzyme này ở các nước châu Âu lên đến 187,2 triệu USD, cao nhất trong các loại enzyme.

Protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược

phẩm, nông nghiệp…Nguồn protease chủ yếu hiện nay thu được từ VSV, đặc biệt là các chủng NS

thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Mucor.

Việc nghiên cứu và phân lập các chủng NS trong tự nhiên để thu nguồn protease mới có giá

trị là vấn đề đang được khoa học quan tâm nghiên cứu. Để thu được nguồn protease mới có giá trị

cần phải phân lập các chủng mới có trong tự nhiên. Một trong những hướng nghiên cứu mà khoa

học đang quan tâm là tìm các chủng VSV mới có đặc tính ưu việt từ RNM. Chính điều kiện sống

khắc nghiệt ở RNM tạo ra nhiều cơ hội tìm thấy các nguồn gen VSV quí hiếm, trong đó có NS sinh

protease.

Ở nước ta, RNM Cần Giờ là nơi HST phong phú, đa dạng. Tuy nhiên, những nghiên cứu về

đa dạng sinh thái của RNM Cần Giờ chủ yếu tiến hành ở hệ động thực vật. VSV, trong đó NS là

một đối tượng được phân bố rộng rãi và có giá trị kinh tế chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong

thời gian gần đây. NS ở RNM Cần Giờ có nhiều đặc tính quí báu như khả năng chịu đựng được điều

kiện sống khắc nghiệt, khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào, trong đó có protease. Do RNM Cần

Giờ có thảm TV dày đặc, xác động thực vật bị phân hủy tạo thành nguồn cơ chất cho các chủng NS

sinh các enzyme ngoại bào.

Cho đến hiện nay, các công trình nghiên cứu về NS ở RNM Cần Giờ vẫn còn thưa thớt, trong

đó vẫn chưa có công trình nghiên cứu về khả năng sinh protease của các chủng NS.

Chính vì những lí do trên mà tôi chọn đề tài “Nghiên cứu và thu nhận enzyme protease từ

các chủng NS ở RNM Cần Giờ”.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: các chủng NS phân lập tại 5 xã Long Hòa, Lí Nhơn,

Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Bình Khánh ở RNM Cần Giờ.

Địa điểm nghiên cứu: PTN Vi sinh-Trường Đại học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh.

Mục tiêu của đề tài: Tìm ra một số chủng NS có khả năng sinh protease mạnh từ RNM Cần

Giờ và nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận protease.

Nhiệm vụ của đề tài:

 Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ.

 Tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh protease cao.

 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và một số đặc tính sinh học của các chủng NS tuyển

chọn.

 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện MT đến ST và hoạt độ protease của các chủng

NS được tuyển chọn, từ đó tìm ra MT tối ưu để nuôi cấy NS thu protease.

 Thu nhận các chế phẩm enzyme bán tinh khiết.

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. RNM Cần Giờ.

1.1.1. Đặc điểm của RNM Cần Giờ.

1.1.1.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên.

Về vị trí địa lý: RNM Cần Giờ có tọa độ 10°22’ – 10°40’ vĩ độ Bắc và 106°46’ – 107°01’

kinh độ Đông. Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi

4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [43].

Hình 1.1. RNM Cần Giờ [43]

Nằm cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 70km, RNM Cần Giờ giáp tỉnh Đồng

Nai ở phía Bắc, giáp biển Đông ở phía Nam, giáp tỉnh Tiền Giang và Long An ở phía Tây, giáp tỉnh

Bà Rịa-Vũng Tàu ở phía Đông [43].

RNM Cần Giờ phát triển trên một nền đất đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng

đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn

hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất

nền rắn chắc, hàm lượng lưu huỳnh dạng khử khá cao với một lượng muối cao không có lợi cho

nông nghiệp[17].

Địa hình: huyện Cần Giờ có địa hình thấp trũng, không bằng phẳng, phân cắt bởi mạng lưới

sông ngòi uốn khúc. Nhìn chung, địa hình huyện Cần Giờ có 6 dạng: dạng cao 2- 10 m, dạng chỉ

ngập vào những tháng có nước lớn (tháng 11, 12) trong năm và 4 dạng còn lại đều ngập triều ở các

mức độ khác nhau [9].

Cần Giờ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới xích đạo, hướng gió chính là Tây Nam, mùa mưa

bắt đầu muộn và kết thúc sớm hơn so với các địa phương khác trong vùng (từ tháng 5 đến tháng 10),

mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau [30]. Nhiệt độ trung bình khoảng 250

C - 290

C, nhiệt độ

thấp nhất là 18,8o

C, cao nhất là 35o

C. Biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5-7o

C [30]. Độ ẩm trung

bình từ 73% đến 85%. Lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.000 – 1.402 mm [66]. Độ mặn dao

động từ 1,8%-3% [2]. Độ mặn cũng thay đổi tùy theo mùa. Vào mùa khô có độ mặn cao hơn vào

mùa mưa. Độ mặn có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố khu hệ SV ở RNM nói chung và NS nói

riêng.

Chế độ thủy triều: Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều không đều của biển

Đông. Mỗi tháng có khoảng 2 ngày nhật triều không đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối

tháng âm lịch. Biên độ triều tương đối lớn từ 3- 4m. Thời gian có biên độ triều lớn từ tháng 6- 8.

Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [9].

Đất đai: toàn bộ huyện Cần Giờ thuộc loại đất phèn mặn gồm hai loại: đất phèn mặn theo

mùa và đất phèn mặn thường xuyên. Đất phèn mặn theo mùa nằm ở phía Bắc huyện Cần Giờ. Đất

thịt, giàu mùn, chứa nhiều xác hữu cơ dưới môi truờng yếm khí, chất dinh dưỡng khá, phản ứng của

đất từ chua đến rất chua, pH ở độ sâu của tầng sinh phèn xuống tới 2,4-2,7. Tuy nhiên vào mùa lũ,

mặn được đẩy ra xa, nước được pha loãng trong thời gian dài 4-5 tháng. Đất phèn mặn thường

xuyên chiếm phần lớn diện tích Cần Giờ. Đất thịt trung bình, nhiều mùn nhão lẫn xác hữu cơ bán

phân giải, bị ngập triều thường ngày, giàu dinh dưỡng, độ pH từ 5,8-6,5 [66].

1.1.1.2. Khu hệ SV ở RNM Cần Giờ.

RNM Cần Giờ là HST trung gian giữa HST thủy vực với HST trên cạn, HST nước ngọt và

HST nước mặn. Rừng Cần Giờ nhận một lượng lớn phù sa từ sông Đồng Nai, cùng với ảnh hưởng

của biển kế cận và các đợt thủy triều nhờ đó hệ TV nơi đây rất phong phú với trên 150 loài và trở

thành nguồn cung cấp thức ăn, nơi trú ngụ cho rất nhiều loài thủy sinh, cá cùng với các ĐV có

xương sống khác. Hệ ĐV cũng rất đa dạng gồm khu hệ chim có khoảng 120 loài, ĐV thủy sinh

không xương sống với trên 700 loài, khu hệ cá trên 130 loài, khu hệ ĐV có xương sống có 9 loài

lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú [44].

Chính hệ động thực vật đa dạng ở RNM Cần Giờ trở thành nguồn thức ăn phong phú cho

các VSV bao gồm nấm men, NS, VK và xạ khuẩn. Nhờ vào khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào

như amylase, protease, kitinase, cellulase,…chúng phân hủy tinh bột protein, kitin,…. có trong xác

động thực vật và giáp xác làm nguồn thức ăn. Và bản thân xác động thực vật bị phân hủy trở thành

nguồn mùn là lượng thức ăn dồi dào cho hệ TV và các SV phù du.

Trung tâm MERD đã nghiên cứu khu hệ VSV ở RNM thuộc các tỉnh Nam Định và Thái

Bình (2001). Kết quả phân lập được 69 chủng nấm men, 55 chủng xạ khuẩn. Nhiều chủng có hoạt

tính enzyme ngoại bào cao, có khả năng sinh KS và phân giải dầu mạnh [13].

Riêng ở RNM Cần Giờ chưa có nhiều công trình nghiên cứu về nấm men và xạ khuẩn. Qua

phân tích các mẫu đất ở RNM Cần Giờ, các nhà khoa học đã phát hiện có vi khuẩn Bacillus

thuringiensis sinh nhiều tinh thể hình cầu có tác dụng tiêu diệt ấu trùng muỗi rất cao. Kết quả thí

nghiệm của nhóm nghiên cứu Mai Thị Hằng và Trần Thị Mỹ Hạnh cho thấy các chủng VSV này có

khả năng diệt các loại ấu trùng muỗi từ 60-100% sau 36 giờ, có chủng diệt được 100% ấu trùng

muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex

quinquefasciatus gây bệnh chân voi [61].

NS ở RNM chiếm số lượng lớn, rất phong phú và đa dạng. Khi lá còn ở trên cây đã có một số

loài nấm sống trên đó, một số chui sâu vào biểu bì, một số sống trên mặt lá. Khi lá rụng xuống, sau

24 giờ ngập nước triều đầu tiên, lá đã bị các VSV phân hủy, lúc đầu là chi Phytophora thuộc lớp

Nấm tảo, rồi đến Fusarium và Penicillium thuộc lớp Nấm bất toàn. Sau tuần thứ 2 và thứ 3, các

nấm tảo nhường chỗ cho các loài VSV khác. Tất cả các mô xốp được phân huỷ nhanh nhất, còn các

hợp chất cellulose và lignin bị phân hủy cuối cùng. Trong quá trình phân hủy, lượng đạm trên các

mẩu lá tăng 2 – 3 lần so với ban đầu (Kaushik và Hynes, 1971). Khi phân tích, so sánh các loại acid

amin có trong lá tươi và lá phân huỷ, Casagrade (1970) đã thấy sự tăng tổng số các acid amin trên

bề mặt lá và trong thành phần lá phân hủy cao hơn hẳn lá tươi. Một số acid amin như α –

aminobyturic, α, γ diaminnobutyric và α, ε diamino pimonic cùng các loại acid citruline, ortrithine,

cystein là các sản phẩm được tạo ra trong quá trình trao đổi chất của VSV [51].

Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã

chứng minh được một điều: ở các hệ sinh thái RNM này có tới 83/199 chủng nấm có khả năng phân

giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Nghiên cứu về RNM ở Nam Định và Thái Bình của trung tâm

MERD cũng phân lập được 605 chủng NS [13].

Ở RNM Cần Giờ, tác giả Khưu Phương Yến Anh đã phân lập được 312 chủng NS, trong đó

bao gồm các loài nấm thuộc các chi Penicillum, Aspergilus, Mucor, Tricoderma (2007) [1]. Tác giả

Võ Thị Bích Viên đã phân lập được 476 chủng NS trong đó có 266 chủng thuộc chi Aspergillus và

Penicillium (2009) [32].

1.1.2. Vai trò của RNM Cần Giờ.

RNM Cần Giờ được mệnh danh là "lá phổi xanh" của TP.HCM với vai trò quan trọng trong

điều hòa khí hậu. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... RNM được