Nghiên cứu ứng dụng qui trình sản xuất một số chế phẩm chuyên dụng chất lượng cao dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử

§¹i häc quèc gia hµ néi

Trung t©m c«ng nghÖ sinh häc

144 Xu©n Thñy – CÇu GiÊy – Hµ Néi

***************

B¸o c¸o tæng kÕt

khoa häc vµ kü thuËt ®Ò tµi:

“nghiªn cøu øng dông qui tr×nh s¶n xuÊt

mét sè chÕ phÈm chuyªn dông chÊt l−îng cao

dïng cho nghiªn cøu sinh häc ph©n tö”

m∙ sè: kc-04-26

Chñ tr× ®Ò tµi: TS. D−¬ng V¨n Hîp

6143

26/10/2006

Hµ Néi, 12-2005

®hqghn

TTCNSH

®hqghn

TTCNSH

TTCNSH

®hqghn

Môc lôc

Néi dung trang

Ch−¬ng I. Nghiªn cøu s¶n xuÊt Taq ADN polymeraza

chÊt l−îng cao

1

I. Tæng quan tµi liÖu 1

1.1. Giíi thiÖu ADN polymeraza 1

1.2. Mét sè ADN polymeraza phæ biÕn dïng trong sinh häc ph©n tö 3

1.2.1. E. coli ADN polymeraza I (E.C.2.7.7.7) 3

1.2.2. T4 ADN polymeraza (E.C.2777) 3

1.2.3. T7 ADN polymeraza (E.C.7.7.7) 3

1.2.4. ADN polymeraza chÞu nhiÖt dïng cho kü thuËt PCR 4

1.2.4.1. Pfu ADN polymeraza 5

1.2.4.2. Taq ADN polymeraza 5

1.3. Mét sè nghiªn cøu tinh s¹ch Taq ADN polymeraza liªn quan ®Õn ®Ò tµi 6

1.4. Nhu cÇu ADN polymeraza ë ViÖt Nam, t×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc

vµ tÝnh cÇn thiÕt, ý nghÜa cña ®Ò tµi

6

II. Nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p 8

2.1. Chñng gièng vi sinh vËt, ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ 8

2.1.1. Chñng vi sinh vËt 8

2.1.2. Ho¸ chÊt 9

2.1.3. ThiÕt bÞ 9

2.1.4. M«i tr−êng nu«i cÊy vi khuÈn 9

2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 10

2.2.1. Sö dông kü thuËt PCR ®Ó nh©n gen Taq ADN polymeraza 10

2.2.2. Ph¸t hiÖn s¶n phÈm PCR trªn gel agarose 11

2.2.3. Ph−¬ng ph¸p tinh s¹ch s¶n phÈm PCR víi phenol vµ cloroform 11

2.2.4. Gi¶i tr×nh tù ADN s¶n phÈm PCR 12

2.2.5. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt plamid theo Sambrook 12

2.2.6. Ph−¬ng ph¸p c¾t plasmid pTTQ18 b»ng enzym giíi h¹n 13

2.2.7. Ph−¬ng ph¸p xö lý s¶n phÈm PCR b»ng enzym giíi h¹n 14

2.2.8. X¸c ®Þnh ®é s¹ch vµ ®Þnh l−îng ADN 14

2.2.9. Nèi plasmid vµ s¶n phÈm PCR ®∙ ®−îc xö lý víi enzym giíi h¹n 14

2.2.10. Ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p plasmid t¸i tæ hîp vµo vi khuÈn E.coli DH5α 15

2.2.11. KiÓm tra tÕ bµo mang plasmid t¸i tæ hîp b»ng kü thuËt PCR 16

2.2.12. KiÓm tra plasmid mang gen Taq ADN polymeraza b»ng enzym c¾t

giíi h¹n

16

2.2.13. BiÕn n¹p plasmid mang gen Taq ADN polymeraza vµo dßng vi

khuÈn Ecoli BL21 dïng cho biÓu hiÖn gen

16

2.2.14. Ph−¬ng ph¸p biÓu hiÖn Taq ADN polymeraza 17

2.2.15. Ph−¬ng ph¸p tinh s¹ch Taq ADN polymeraza (1000 ml) 17

2.2.15.1. T¸ch, thu Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 17

2.2.15.2. Xö lý nhiÖt 18

2.2.15.3. Tinh s¹ch qua cét s¾c kÝ trao ®æi anion Mono-Q 18

2.2.15.4. Tinh s¹ch qua cét s¾c kÝ ¸i lùc Heparin-Sepharose 4B 18

2.2.15.5. Lo¹i ADN E.coli khái chÕ phÈm 19

2.2.15.6. KiÓm tra ®é tinh s¹ch Taq ADN polymeraza trªn SDS-PAGE 19

2.2.15.7. KiÓm tra ®é s¹ch trªn thiÐt bÞ HPLC 19

2.2.15.8. KiÓm tra møc ®é nhiÔm ADN E.coli b»ng kÜ thuËt RADP 19

2.2.15.9. Ph¶n øng RADP 19

2.2.16. §¸nh gi¸ ho¹t tÝnh enzym Taq ADN polymeraza 20

2.2.17. Lùa chän thµnh phÇn ®Öm cho ph¶n øng enzym Taq ADN polymeraza 20

2.2.18. Lùa chän thµnh phÇn ®Öm b¶o qu¶n enzym Taq ADN polymeraza 21

2.2.19. Nghiªn cøu ®é bÒn nhiÖt cña enzym Taq ADN polymeraza 21

2.2.20. ¶nh h−ëng thêi gian b¶o qu¶n ®Õn ho¹t tÝnh enzym 21

2.2.21. §¸nh gi¸ ®é nhiÔm nucleaza cña chÕ phÈm 22

2.2.22. X¸c ®Þnh protein theo ph−¬ng ph¸p Bradford (1976) 22

2.2.23. Ph¸t hiÖn protein trªn gel SDS-PAGE 23

III. kÕt qu¶ nghiªn cøu 25

3.1. Nh©n gen Taq ADN Polymeraza 25

3.1.1. ThiÕt kÕ cÆp måi nh©n gen Taq ADN polymeraza 25

3.1.2. Ph¶n øng nh©n gen Taq ADN polymeraza 25

3.1.3. Gi¶i tr×nh tù s¶n phÈm PCR 26

3.2. ThiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn gen Taq ADN polymeraza 30

3.2.1. ThiÕt kÕ vect¬ 30

3.2.2. KiÓm tra kÕt qu¶ thiÕt kÕ plasmid t¸i tæ hîp mang gen Taq ADN polymeraza 32

3.2.2.1. KiÓm tra dßng tÕ bµo biÕn n¹p b»ng kÜ thuËt PCR 32

3.2.2.2. KiÓm tra khung dÞch m· (ORF- openreading frame) 33

3.3. Nghiªn cøu biÓu hiÖn enzym Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 35

3.3.1. TiÕn hµnh biÕn n¹p plasmid t¸i tæ hîp mang gen Taq ADN polymeraza

Õ

35

vµo dßng tÕ bµo E.coli BL.21

3.3.2. KiÓm tra b»ng kü thuËt PCR 35

3.3.3. Chän dßng tÕ bµo biÓu hiÖn gen 36

3.3.4. Tèi −u ho¸ ®iÒu kiÖn biÓu hiÖn Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp trong

vi khuÈn E.coli BL21

37

3.4. Nghiªn cøu t¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 39

3.4.1. T¸ch chiÕt Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 39

3.4.2. Xö lý nhiÖt dÞch t¸ch chiÕt Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 40

3.4.3. Tinh s¹ch qua cét s¾c ký trao ®æi anion Mono-Q 40

3.4.4. Tinh s¹ch qua cét s¾c kÝ ¸i lùc Heparin Sepharose 4B 42

3.4.5. Lo¹i ADN nhiÔm khái chÕ phÈm Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 43

3.4.6. Qui tr×nh ng¾n gän tãm t¾t c¸c b−íc tinh s¹ch Taq ADN polymeraza

t¸i tæ hîp

43

3.5. §¸nh gi¸ ®é s¹ch cña Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 46

3.5.1. §¸nh gi¸ ®é s¹ch protein 46

3.5.2. §¸nh gi¸ ®é nhiÔm ADN vi khuÈn E.coli 47

3.5.3. §¸nh gi¸ ®é nhiÔm nucleaza 49

3.6. §¸nh gi¸ ho¹t tÝnh enzym 49

3.6.1. X¸c ®Þnh ho¹t ®é t−¬ng ®èi 49

3.6.2. §¸nh gi¸ kh¶ n¨ng nh©n c¸c ®o¹n gen cã kÝch th−íc kh¸c nhau 51

3.7. Nghiªn cøu ®iÒu kiÖn lµm bÒn ho¹t tÝnh enzym 52

3.7.1. ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é ®Õn ho¹t tÝnh enzym Taq ADN polymeraza t¸i tæ hîp 52

3.7.2. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña thêi gian b¶o qu¶n ®Õn ho¹t tÝnh enzym Taq

ADN polymeraza t¸i tæ hîp

53

3.7.3. ¶nh h−ëng cña ®Öm b¶o qu¶n ®Õn ho¹t tÝnh enzym 53

3.7.4. ¶nh h−ëng cña ®Öm ph¶n øng ®Õn ho¹t tÝnh enzym 54

Ch−¬ng II. Nghiªn cøu s¶n xuÊt T4 ADN ligaza 56

I. Tæng quan tµi liÖu 56

1.1. §Æc ®iÓm chung cña ADN ligaza 56

1.2. E. coli ADN ligaza (E.C.6.5.1.2) 57

1.3. T4 ADN ligaza 57

1.3.1. C¸c cofactor cña T4 ADN ligaza 58

1.3.2. C¸c yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn ho¹t tÝnh cña T4 ADN ligaza 58

1.3.3. CÊu tróc cña T4 ADN ligaza 60

1.3.4. CÊu tróc cña gen m∙ ho¸ cho T4 ADN ligaza 60

II. Nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p 62

2.1. Nguyªn liÖu 62

2.1.1. Chñng vi sinh vËt 62

2.1.2. Vect¬ t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen 63

2.1.3. Hãa chÊt 63

2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 63

2.2.1. Ph−¬ng ph¸p PCR nh©n gen T4 ADN ligaza 63

2.2.2. Ph−¬ng ph¸p tinh s¹ch s¶n phÈm PCR 65

2.2.3. Ph−¬ng ph¸p t¸ch chiÕt plamid theo Sambrook 65

2.2.4. Ph−¬ng ph¸p c¾t plasmid b»ng enzym giíi h¹n 66

2.2.5. Ph−¬ng ph¸p c¾t s¶n phÈm PCR b»ng enzym giíi h¹n 66

2.2.6. Nèi plasmid vµ s¶n phÈm PCR ®∙ ®−îc xö lý víi enzym giíi h¹n 67

2.2.7. Ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p plasmid t¸i tæ hîp 67

2.2.8. KiÓm tra tÕ bµo mang plasmid t¸i tæ hîp b»ng kü thuËt PCR 68

2.2.9. Ph−¬ng ph¸p biÓu hiÖn 68

2.2.10. Ph−¬ng ph¸p t¸ch vµ tinh s¹ch T4 ADN ligaza 70

2.2.10.1. T¸ch chiÕt T4 ADN ligaza 70

2.2.10.2. Tinh s¹ch T4 ADN ligaza 70

2.2.11. §¸nh gi¸ chÊt l−îng enzym T4 ADN 71

2.2.11.1. §¸nh gi¸ ®é s¹ch protein 71

2.2.11.2. §¸nh gi¸ ®é s¹ch ADN vi khuÈn E. coli 71

2.2.11.3. §¸nh gi¸ ®é nhiÔm nucleaza 71

2.2.12. Lùa chän ®Öm b¶o qu¶n enzym T4 ADN ligaza 71

2.2.13. §¸nh gi¸ ho¹t ®é enzym T4 ADN ligaza 72

2.2.13.1. X¸c ®Þnh ho¹t ®é t−¬ng ®èi cña T4 ADN ligaza 72

2.2.13.2. Lùa chän mét sè ®Öm ph¶n øng cho T4 ADN ligaza 72

III. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn 73

3.1. Nh©n gen T4 ADN ligaza b»ng kü thuËt PCR 73

3.1.1. Ph¶n øng nh©n gen T4 ADN ligaza 73

3.1.2. Gi¶i tr×nh tù s¶n phÈm PCR 73

3.2. ThiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn gen 76

3.2.1. ThiÕt kÕ vect¬ t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen T4 ADN ligaza 76

3.2.2. Lùa chän dßng tÕ bµo biÕn n¹p mang gen T4 ADN ligaza 76

3.2.3. KiÓm tra kÕt qu¶ thiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn gen b»ng enzym c¾t h¹n chÕ 76

3.3. BiÓu hiÖn gen t¸i tæ hîp 79

3.3.1. BiÕn n¹p plasmid pET-14b-55 vµo E. coli BL21 79

3.3.2. KiÓm tra plasmid t¸i tæ hîp b»ng kü thuËt PCR 79

3.3.3. BiÓu hiÖn T4 ADN ligaza t¸i tæ hîp 80

3.4. T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch T4 ADN ligaza t¸i tæ hîp 81

3.4.1. T¸ch chiÕt T4 ADN ligaza t¸i tæ hîp 81

3.4.2. Tinh s¹ch T4 ADN ligaza t¸i tæ hîp 82

3.5. §¸nh gi¸ chÊt l−îng enzym 84

3.5.1. §¸nh gi¸ ®é s¹ch protein trªn hÖ thèng HPLC 84

3.5.2. §¸nh gi¸ ®é nhiÔm nucleaza 85

3.5.3. §¸nh gi¸ ®é nhiÔm ADN vi khuÈn E. coli 86

3.6. §¸nh gi¸ ho¹t ®é enzym 87

3.7. §¸nh gi¸ ®iÒu kiÖn lµm bÒn ho¹t tÝnh enzym T4 ADN ligaza 87

3.7.1. Lùa chän ®Öm ph¶n øng thÝch hîp cho ho¹t tÝnh T4 ADN ligaza 87

3.7.2. Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña ®Öm b¶o qu¶n ®Õn ho¹t tÝnh enzym T4

ADN ligaza

88

Ch−¬ng III. S¶n xuÊt thang chuÈn ADN 89

I. Tæng quan 89

1.1. Giíi thiÖu chung 89

1.2. Mét sè nghiªn cøu s¶n xuÊt thang chuÈn ADN 91

1.3. Nhu cÇu vµ t×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc 93

II. VËt liÖu vµ Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 94

2.1. V©t liÖu nghiªn cøu 94

2.1.1. Dßng tÕ bµo 94

2.1.2. Plasmid 94

2.1.3. Nguån ADN lµm sîi khu«n 95

2.1.4. C¸c cÆp måi 98

2.1.5. Ho¸ chÊt 101

2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 101

2.2.1. Ph−¬ng ph¸p nh©n c¸c ®o¹n gen cã kÝch th−íc kh¸c nhau b»ng kÜ

thuËt PCR

101

2.2.2. Tinh s¹ch s¶n phÈm PCR vµ phèi trén thang chuÈn 200 bp 102

2.2.3. Nh©n gen vµ chuÈn bÞ c¸c ®o¹n gen ®Ó thiÕt kÕ c¸c vect¬ dïng lµm

thang chuÈn

103

2.2.3.1. Nh©n gen 103

2.2.3.2. Xö lý c¸c s¶n phÈm PCR 103

2.2.3.3. ThiÕt kÕ c¸c vect¬ mang c¸c ®o¹n thang chuÈn ADN 104

2.2.3.4. Tinh s¹ch s¶n phÈm PCR vµ s¶n phÈm sau khi xö lý vect¬ víi

enzym c¾t h¹n chÕ

105

2.2.3.5. KiÓm tra kÕt qu¶ xö lý enzym c¾t h¹n chÕ víi vect¬ mang c¸c ®o¹n

thang chuÈn

105

2.2.3.6. Phèi trén t¹o thang chuÈn ADN 105

III. KÕt qu¶ nghiªn cøu 106

3.1. Nh©n gen cã kÝch th−íc kh¸c nhau khi dïng pBluescript lµm sîi khu«n 106

3.2. ThiÕt kÕ thang chuÈn 200 bp tõ s¶n phÈm nh©n gen b»ng kü thuËt PCR 106

3.3. ThiÕt kÕ c¸c vect¬ mang c¸c ®o¹n gen cã kÝch th−íc kh¸c nhau 108

3.4. Phèi trén t¹o thang chuÈn ADN 111

KÕt luËn 116

KiÕn nghÞ 122

Tµi liÖu tham kh¶o 123

Lêi c¶m ¬n

Trung t©m C«ng nghÖ Sinh häc - §¹i häc Quèc Gia Hµ néi, c¬

quan chñ tr× ®Ò tµi KC-04-26, Chñ nhiÖm ®Ò tµi vµ tÊt c¶ c¸c thµnh viªn ®Ò

tµi KC-04-26 xin ch©n thµnh c¶m ¬n Bé khoa häc C«ng nghÖ, ®Æc biÖt lµ

Vô Qu¶n lý Khoa häc C«ng nghÖ c¸c ngµnh Kinh tÕ kü thuËt, Vô KÕ

ho¹ch -Tµi chÝnh, L∙nh ®¹o §¹i häc Quèc Gia Hµ Néi, «ng chñ nhiÖm vµ

Ban chñ nhiÖm, v¨n phßng vµ Ban th− ký ch−¬ng tr×nh KC-04 ®∙ ñng hé,

quan t©m chØ ®¹o kÞp thêi vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi ®Ó ®Ò tµi hoµn

thµnh tèt c¸c môc tiªu vµ nhiÖm vô ®Ò ra.

C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi vµ chñ tr× ®Ò tµi ®¸nh gi¸ cao sù phèi hîp cã

tr¸ch nhiÖm vµ hiÖu qu¶ cña c¸c c¸n bé chñ tr× vµ thùc hiÖn ®Ò tµi nh¸nh,

c¬ quan chñ tr× c¸c ®Ò tµi nh¸nh: §¹i häc Y Hµ Néi, ViÖn Sèt rÐt vµ Ký

sinh trïng Trung −¬ng, §¹i häc Khoa Häc Tù nhiªn- §¹i häc Quèc Gia

Hµ Néi .

§ång thêi chóng t«i còng ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c c¸ nh©n, ®¬n vÞ

®∙ tin cËy sö dông vµ cã ý kiÕn ®ãng gãp nh»m n©ng cao chÊt l−îng s¶n

phÈm cña ®Ò tµi.

I. Th«ng tin chung vÒ ®Ò tµi

1. Tªn ®Ò tµi:

Nghiªn cøu øng dông qui tr×nh s¶n xuÊt

mét sè chÕ phÈm chuyªn dông chÊt l−îng

cao dïng cho nghiªn cøu sinh häc ph©n tö

2. M∙ sè

KC-04-26

3. Thêi gian thùc hiÖn: 24 th¸ng

(Tõ th¸ng 1/2004 ®Õn th¸ng 12/2005 )

4. CÊp qu¶n lý

Nhµ n−íc Bé C¬ së

TØnh

5. Kinh phÝ

Tæng sè: 2200 triÖu ®ång

Trong ®ã, tõ Ng©n s¸ch SNKH: 2100 triÖu

6. Thuéc Ch−¬ng tr×nh (nÕu cã):

Nghiªn cøu khoa häc vµ ph¸t triÓn c«ng nghÖ sinh häc

7 Chñ nhiÖm ®Ò tµi

Hä vµ tªn: D−¬ng V¨n Hîp

Häc hµm/häc vÞ: TiÕn sÜ

Chøc danh khoa häc: C¸n bé nghiªn cøu viªn chÝnh

§iÖn tho¹i: 7541695/7540907(CQ) / 8682389 (NR) Fax: 7540907

Mobile: 0912307638

E-mail: [email protected]

§Þa chØ c¬ quan: Trung t©m C«ng nghÖ Sinh häc, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi

Nhµ E2, 144 §−êng Xu©n Thuû, Hµ Néi

§Þa chØ nhµ riªng: F 501, E1, ngâ 27 T¹ Quang Böu - §¹i häc B¸ch khoa Hµ Néi

8 C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi

Tªn tæ chøc KH&CN: Trung t©m C«ng nghÖ Sinh häc, §¹i häc Quèc gia Hµ Néi

§iÖn tho¹i: 7540907 Fax: 7540907

E-mail: [email protected]

§Þa chØ: Nhµ E2,144 §−êng Xu©n Thuû, Hµ Néi

X

Néi dung KH&CN cña ®Ò tµi

9 Môc tiªu cña ®Ò tµi

9.1. Môc tiªu chung:

øng dông ®−îc qui tr×nh c«ng nghÖ ®Ó s¶n xuÊt c¸c enzym chuyªn dông cã

chÊt l−îng cao dïng trong c«ng nghÖ sinh häc.

9.2. C¸c môc tiªu cô thÓ:

1. Nh©n dßng, thiÕt kÕ c¸c vect¬ mang gen nh»m t¹o ®−îc hai dßng vi khuÈn

E.coli biÓu hiÖn hai enzym t¸i tæ hîp ADN polymeraza vµ T4 ADN ligaza.

2. Tèi −u ho¸ viÖc biÓu hiÖn gen, tinh s¹ch, nghiªn cøu ®iÒu kiÖn lµm bÒn vµ duy

tr× ho¹t tÝnh enzym ADN polymeraza vµ T4 ADN ligaza t¸i tæ hîp cã chÊt

l−îng cao t−¬ng ®−¬ng víi c¸c enzym nhËp ngo¹i (Fermentas, Promega).

3. TriÓn khai s¶n xuÊt hai chÕ phÈm enzym ë qui m« pilot víi l−îng enzym thu

®−îc lµ 50.000 ®¬n vÞ mçi lo¹i nh»m cung cÊp cho nhu cÇu trong n−íc víi gi¸

thµnh chØ b»ng 1/ 4 gi¸ enzym nhËp ngo¹i cã cïng chÊt l−îng.

4. ChÕ t¹o ®−îc hai thang chuÈn ADN cã kÝch th−íc chÝnh x¸c dïng cho sinh häc

ph©n tö.

5. §¸nh gi¸ chÊt l−îng vµ kh¶ n¨ng sö dông thùc tÕ c¸c enzym vµ thang chuÈn

ADN t¹i 5 phßng thÝ nghiÖm sinh häc ph©n tö trong n−íc, trªn c¬ së so s¸nh vÒ

chÊt l−îng víi c¸c sinh phÈm nhËp ngo¹i.

6. N©ng cao n¨ng lùc cña ®¬n vÞ trong viÖc ®µo t¹o c¸n bé khoa häc trÎ vÒ sinh

häc ph©n tö vµ c«ng nghiÖp sinh häc (bioindustry).

Danh s¸ch c¸n bé tham gia ®Ò tµi

STT Hä vµ tªn C¬ quan

1 TS. D−¬ng V¨n Hîp Trung t©m C«ng nghÖ Sinh häc

§¹i häc Quèc gia Hµ Néi

2 GS. NguyÔn L©n Dòng Nt

3 GS. Pham ThÞ Tr©n Ch©u Nt

4 TS. NguyÔn ThÞ Hoµi Hµ Nt

5 TS. Ph¹m ThÞ HuÊn Nt

6 Ths. Phan ThÞ Hµ Nt

7 Ths. §µo ThÞ L−¬ng Nt

8 Ths. Chu ThÞ Thanh B×nh Nt

9 Ths. Ph¹m ThÕ H¶i Nt

10 Th.S. TrÞnh TÊt C−êng Nt

11 CN: NguyÔn ThÞ Kim Qui Nt

12 CN. Bïi Xu©n Long Nt

13 PGS. TS. TrÞnh Hång Th¸i §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn, §HQG Hµ Néi

14 PGS. TS. Lª V¨n Phñng §¹i häc Y Hµ Néi

15 Ths. Lª §øc §µo ViÖn Sèt rÐt vµ KÝ sinh trïng Trung −¬ng

Bµi tãm t¾t

KÓ tõ n¨m 1993 ®Õn nay khi chñ tr−¬ng ®óng ®¾n cña §¶ng vµ Nhµ

n−íc coi C«ng nghÖ Sinh häc (CNSH) lµ mét trong nh÷ng h−íng −u tiªn cho

ph¸t triÓn ®Êt n−íc ®©y lµ ®éng lùc quan träng cho c¸c ®¬n vÞ nghiªn cøu

CNSH tiÕp cËn kü thuËt hiÖn ®¹i nh»m n©ng cao chÊt l−îng nghiªn cøu phôc

vô cuéc sèng trong n−íc. Mét sè c¬ së nghiªn cøu trong n−íc ®· n©ng cÊp

®iÒu kiÖn thiÕt bÞ vµ ho¸ chÊt tèt, ®¹t yªu cÇu cho nghiªn cøu sinh häc ph©n

tö . Tuy nhiªn viÖc cung cÊp c¸c enzym, sinh phÈm cho c¸c nghiªn cøu sinh

häc ph©n tö gÆp hai khã kh¨n chñ yÕu lµ gi¸ thµnh cao vµ chÊt l−îng kh«ng

æn ®Þnh do nh÷ng thay ®æi vÒ ®iÒu kiÖn, thêi gian b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn tõ

khi s¶n xuÊt ®Õn khi sö dông.

Nh»m kh¾c phôc khã kh¨n trªn trong nh÷ng n¨m 1998-2003 chóng t«i

®· tiÕn hµnh c¸c c«ng viÖc nghiªn cøu enzym Taq ADN polymeraza t¸i tæ

hîp dïng trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö t¹i ®¬n vÞ. S¶n phÈm thu ®−îc

víi kÕt qu¶ ban ®Çu cho chóng t«i tin t−ëng vµo kh¶ n¨ng cña tËp thÓ c¸n bé

trong viÖc tiÕp cËn c«ng nghÖ gen, protein ®Ó s¶n xuÊt enzym Taq ADN

polymeraza, T4 ADN ligaza vµ thang chuÈn ADN ®¹t chÊt l−îng cho nghiªn

cøu sinh häc ph©n tö trong n−íc, tõng b−íc thay s¶n phÈm nhËp ngo¹i.

Trong giai ®o¹n 2004-2005 chóng t«i ®−îc giao nhiÖm vô thùc hiÖn

®Ò tµi KC-04-26: Nghiªn cøu øng dông qui tr×nh s¶n xuÊt mét sè chÕ

phÈm chuyªn dông chÊt l−îng cao dïng cho nghiªn cøu sinh häc ph©n tö.

Víi c¸c môc tiªu chñ yÕu sau:

• Nh©n dßng, thiÕt kÕ c¸c vect¬ mang gen nh»m t¹o ®−îc hai dßng vi khuÈn

E.coli biÓu hiÖn hai enzym t¸i tæ hîp ADN polymeraza vµ T4 ADN

ligaza.

• Tèi −u ho¸ viÖc biÓu hiÖn gen, tinh s¹ch, nghiªn cøu ®iÒu kiÖn lµm bÒn vµ

duy tr× ho¹t tÝnh enzym ADN polymeraza vµ T4 ADN ligaza t¸i tæ hîp cã

chÊt l−îng cao t−¬ng ®−¬ng víi c¸c enzym nhËp ngo¹i (Fermentas,

Promega-Mü).

• TriÓn khai s¶n xuÊt hai chÕ phÈm enzym ë qui m« pilot víi l−îng enzym

thu ®−îc lµ 50.000 ®¬n vÞ mçi lo¹i nh»m cung cÊp cho nhu cÇu trong

n−íc víi gi¸ thµnh chØ b»ng 1/4 gi¸ enzym nhËp ngo¹i cã cïng chÊt l−îng.

• ChÕ t¹o ®−îc hai thang chuÈn ADN cã kÝch th−íc chÝnh x¸c dïng cho

sinh häc ph©n tö.

• §¸nh gi¸ chÊt l−îng vµ kh¶ n¨ng sö dông thùc tÕ c¸c enzym vµ thang

chuÈn ADN t¹i 5 phßng thÝ nghiÖm sinh häc ph©n tö trong n−íc, trªn c¬

së so s¸nh vÒ chÊt l−îng víi c¸c sinh phÈm nhËp ngo¹i.

• N©ng cao n¨ng lùc cña ®¬n vÞ trong viÖc ®µo t¹o c¸n bé khoa häc trÎ vÒ

sinh häc ph©n tö .

§Ó thùc hiÖn c¸c môc tiªu trªn qua 2 n¨m thùc hiÖn ®Ò tµi (2004-2005)

chóng t«i ®· tËp hîp ®−îc thùc hiÖn ®Ò tµi lµ c¸c c¸n bé khoa häc cã kinh

nghiÖm ®−îc ®µo t¹o vµ lµm viÖc ë n−íc ngoµi thuéc c¸c ®¬n vÞ nh− :Trung

t©m C«ng nghÖ Sinh häc-§¹i häc Quèc Gia Hµ Néi, §¹i häc Khoa Häc Tù

nhiªn-§¹i häc Quèc Gia Hµ Néi, ViÖn Sèt rÐt vµ KÝ sinh trïng Trung −¬ng,

§¹i häc Y Hµ Néi. Cho ®Õn nay, chóng t«i xin ®−îc b¸o c¸o víi Ban chñ

nhiÖm Ch−¬ng tr×nh KC-04 kÕt qu¶ nghiªn cøu hoµn thµnh c¸c néi dung cña

®Ò tµi nh− sau:

1. Ph©n lËp vµ ®äc tr×nh tù gen T4 ADN ligaza vµ ADN polymeraza,

gåm c¸c c«ng viÖc cô thÓ.

Chóng t«i ®· tiÕn hµnh thiÕt kÕt c¸c cÆp måi nh©n gen Taq ADN

polymeraza (TaqF vµ TaqR) vµ T4 ADN ligaza ( LigF vµ LigR).

Chän ®−îc ®iÒu kiÖn thÝch hîp cho ph¶n øng nh©n hai gen Taq ADN

polymeraza vµ T4 ADN ligaza.

KÕt qu¶ chóng t«i thu ®−îc hai s¶n phÈm PCR lµ gen Taq ADN

polymeraza cã kÝch th−íc kho¶ng 2.500 bp vµ gen T4 ADN ligaza cã kÝch

th−íc kho¶ng 1.500 bp.

Chóng t«i tiÕp tôc tiÕn hµnh gi¶i tr×nh tù hai gen vµ kÕt qu¶ so víi ng©n

hµng gen (BLAST SEARCH) cho thÊy chóng ®Òu cho s¶n phÈm lµ gen Taq

ADN polymeraza kÝch th−íc 2.490 bp m· ho¸ cho 830 axit amin vµ gen T4

ADN polymeraza kÝch th−íc lµ 1.464 bp m· ho¸ cho 488 axit amin. B−íc

tiÕp theo lµ kü thuËt thiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn gen. Víi gen Taq ADN

polymeraza chóng t«i nèi vµo vect¬ pUCQ18 cßn víi gen T4 ADN ligaza

chóng t«i nèi vµo c¸c vect¬ pET-14b, pET-28a. Vect¬ t¸i tæ hîp mang c¸c

gen t−¬ng øng ®−îc biÕn n¹p vµo dßng vi khuÈn E.coli DH5α. KiÓm tra kÕt

qu¶ thiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn gen b»ng kü thuËt gi¶i tr×nh tù ®o¹n nèi vµ xö lý

víi enzym giíi h¹n cho thÊy kÕt qu¶ thiÕt kÕ vect¬ ®¹t kÕt qu¶ mong muèn.

2. T¹o dßng vi khuÈn mang gen T4 ADN ligaza vµ ADN polymeraza

t¸i tæ hîp vµ nghiªn cøu biÓu hiÖn hai enzym T4 ADN ligaza vµ ADN

polymeraza.

Sau khi thu ®−îc c¸c dßng vi khuÈn E.coli mang vect¬ t¸i tæ hîp víi c¸c

gen t−¬ng øng chóng t«i tiÕn hµnh tinh s¹ch plasmit t¸i tæ hîp, kiÓm tra b»ng

kÜ thuËt PCR vµ c¾t b»ng enzym giíi h¹n. Khi ®· ch¾c ch¾n thu ®−îc plasmit

t¸i tæ hîp chóng t«i tiÕn hµnh biÕn n¹p vµo dßng vi khuÈn biÓu hiÖn gen

E.coli BL-21. Thu ®−îc c¸c dßng biÕn n¹p, kiÓm tra b»ng kü thuËt PCR,

chóng t«i kiÓm tra møc ®é biÓu hiÖn gen cña c¸c dßng kh¸c nhau vµ chän

c¸c dßng cã møc ®é biÓu hiÖn m¹nh nhÊt dùa vµ b¨ng protein t¸i tæ hîp

t−¬ng øng cho Taq ADN polymeraza (94 kD) vµ T4 ADN ligaza (55 kD) trªn

SDS -PAGE. Sau khi ®· chän ®−îc dßng tÕ bµo, chóng t«i lÇn l−ît thùc hiÖn

tèi −u ho¸ c¸c ®iÒu kiÖn quan träng cho biÓu hiÖn protein t¸i tæ hîp nh− nhiÖt