Nghiên cứu tổng hợp chất mang thuốc nanopolymer polyamidoamin (PAMAM) biến tính bằng các tác nhân hướng đích (axit folic, peptit, kháng thể..)

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG

THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)

BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN

TẾ BÀO UNG THƢ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2016

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN THỊ BÍCH TRÂM

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP HỆ CHẤT MANG

THUỐC NANO POLYAMIDOAMINE (PAMAM)

BIẾN TÍNH CÓ KHẢ NĂNG HƢỚNG ĐÍCH ĐẾN

TẾ BÀO UNG THƢ

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số chuyên ngành: 62 44 01 14

Phản biện độc lập 1:

Phản biện độc lập 2:

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS.TS NGUYỄN CỬU KHOA

2. GS.TS NGUYỄN CÔNG HÀO

i

LỜI CAM ĐOAN

Công trình đƣợc thực hiện tại phòng Hóa dƣợc – Viện Khoa học Vật liệu ứng

dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh.

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn

khoa học của PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và GS.TS Nguyễn Công Hào. Các nội dung

nghiên cứu, kết quả trong luận án này là trung thực, đƣợc hoàn thành dựa trên các kết

quả nghiên cứu của tôi và các kết quả này chƣa đƣợc dùng cho bất kỳ luận văn cùng

cấp nào.

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Bích Trâm

ii

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và GS.TS Nguyễn Công

Hào đã định hƣớng khoa học, giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án.

Xin gởi đến Thầy những lời biết ơn chân thành nhất.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của TS. Trần Ngọc Quyển và những anh chị trong Viện

Khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam.

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Công nghệ Hóa

học trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án.

Sau cùng, tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên,

giúp đỡ cho tôi hoàn thành luận án này.

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN..........................................................................................4

1.1 GIỚI THIỆU DENDRIMER .............................................................................4

1.1.1 Khái niệm về dendrimer..............................................................................4

1.1.2 Tính chất của dendrimer..............................................................................6

1.1.3 Các phƣơng pháp tổng hợp .......................................................................11

1.1.4 Ứng dụng dendrimer PAMAM làm chất mang thuốc chống ung thƣ

hƣớng đích .............................................................................................................15

1.2 BIẾN TÍNH BỀ MẶT DENDRIMER PAMAM.............................................19

1.2.1 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân tƣơng hợp sinh học ..................20

1.2.2 Biến tính bề mặt dendrimer với tác nhân hƣớng đích...............................20

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƢỚC ĐÂY ........................................................22

1.3.1 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân alkyl hóa

…………………………………………………………………………...22

1.3.2 Những nghiên cứu biến tính dendrimer PAMAM với các tác nhân hƣớng

đích – acid folic .....................................................................................................25

1.4 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ CỦA

DENDRIMER VÀ DẪN XUẤT...............................................................................28

1.4.1 Xác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất dựa vào phổ MALDI￾TOF-MS (WtMALD) ................................................................................................28

1.4.2 Xác định khối lƣợng phân tử polymer dựa vào phổ 1H-NMR..................30

1.4.3 Một số phƣơng pháp khác định khối lƣợng phân tử dendrimer và dẫn xuất.......30

CHƢƠNG 2 - NGHIÊN CỨU ......................................................................................32

2.1 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................................32

iv

2.1.1 Nội dung nghiên cứu .................................................................................32

2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu...........................................................................34

2.2 THỰC NGHIỆM .............................................................................................48

2.2.1 Hóa chất.....................................................................................................48

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ....................................................................................49

2.2.3 Thực nghiệm .............................................................................................50

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..................................................................72

3.1 TỔNG HỢP DENDRIMER PAMAM TỪ THẾ HỆ G-0.5 ĐẾN G3.0 ..........72

3.1.1 Xác định cấu trúc các dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-MNR..........72

3.1.2 Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ khối

lƣợng MS...............................................................................................................79

3.1.3 Xác định khối lƣợng phân tử của dendrimer PAMAM dựa vào phổ 1H-NMR

…………………………………………………………………………...80

3.2 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM VỚI TÁC NHÂN ALKYL ................84

3.2.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride .............................84

3.2.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..........................91

3.2.3 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ......................................95

3.2.4 Biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine ................................99

3.3 BIẾN TÍNH DENDRIMER PAMAM G3.0 VỚI TÁC NHÂN HƢỚNG ĐÍCH

– ACID FOLIC........................................................................................................105

3.4.1 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với tác nhân hƣớng đích - acid folic

105

3.4.2 Biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hexanoyl chloride và tác nhân

hƣớng đích - acid folic.........................................................................................108

3.4 KẾT QUẢ THỬ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO .........................................................112

3.5 KẾT QUẢ THÂM NHẬP TẾ BÀO ..............................................................113

v

3.6 XÁC ĐỊNH KÍCH THƢỚC NANO CỦA DENDRIMER G3.0 VÀ MỘT SỐ

DẪN XUẤT ............................................................................................................116

3.7 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG MANG VÀ NHẢ THUỐC.................................117

3.7.1 Khảo sát khả năng mang (nang hóa) thuốc chống ung thƣ 5-fluorouracil

………………………………………………………………………….117

3.7.2 Khảo sát khả năng nhả thuốc ..................................................................119

KẾT LUẬN .................................................................................................................120

KIẾN NGHỊ.................................................................................................................122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN............123

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................

PHỤ LỤC ..........................................................................................................................

vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Đánh giá khối lƣợng phân tử PAMAM và dẫn xuất dựa vào MALDI-TOF-MS [77]

.......................................................................................................................................29

Bảng 1.2: Khối lƣợng phân tử tính toán theo lý thuyết (WtLT) của các dendrimer

PAMAM từ G-0.5 – G3.0 [1, 98]................................................................................31

Bảng 2.1: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (e), (a) trên phân tử dendrimer (LT)của các dendrimer

PAMAM từ G-0.5 đến G3.0..........................................................................................42

Bảng 2.2: Tỉ lệ proton ở 2 vị trí (j), (a) trên phân tử dẫn xuất alkyl-dendrimer PAMAM G3.0 (LT)

.......................................................................................................................................44

Bảng 2.3 Một số thông số vật lý của hóa chất ..............................................................48

Bảng 3.1: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

.......................................................................................................................................78

Bảng 3.2: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở

khối phổ MS ..................................................................................................................79

Bảng 3.3: Tỉ lệ diện tích các tín hiệu proton ở 2 vị trí (a), (e) thể hiện trên phổ

1H￾MNR (NMR) của các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 ..................................80

Bảng 3.4: Khối lƣợng phân tử các dendrimer PAMAM từ G-0.5 đến G3.0 trên cơ sở

phổ

1H-NMR và MS......................................................................................................82

Bảng 3.5: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát biến tính dendrimer PAMAM

G3.0 với decanoyl chloride theo thời gian ....................................................................85

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride

theo thời gian .................................................................................................................87

Bảng 3.7: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride

.......................................................................................................................................89

Bảng 3.8: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các tác nhân acyl chloride

.......................................................................................................................................90

Bảng 3.9: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0- acid carboxylic

.......................................................................................................................................92

Bảng 3.10: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với các acid carboxylic .......93

Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol

.......................................................................................................................................96

Bảng 3.12: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcoholhol .....................97

Bảng 3.13: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính

dendrimer PAMAM G2.5 với dodecylamine ..............................................................100

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng biến tính dendrimer PAMAM G2.5

với dodecylamine.........................................................................................................101

Bảng 3.15: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm biến tính dendrimer PAMAM G2.5

với alkylamine .............................................................................................................103

vii

Bảng 3.16: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine...................104

Bảng 3.17: Dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm G3.0-FA.........................................106

Bảng 3.18: Dữ liệu phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA...110

viii

DANH MỤC CÔNG THỨC

Công thức 2.1: Công thức tính khối lƣợng phân tử dendrimer PAMAM dựa trên phổ

1H-NMR

.......................................................................................................................................41

Công thức 2.2: Công thức tính độ chuyển hóa của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0

thông qua phổ

1H-NMR.................................................................................................44

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử dendrimer [2] ......................................................................4

Hình 1.2: Các thế hệ dendrimer [4]................................................................................5

Hình 1.3: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là EDA thế hệ chẵn .............................5

Hình 1.4: Cấu trúc dendrimer PAMAM với lõi là hexane diamine thế hệ lẻ.................6

Hình 1.5: Các dạng phân bố dendrimer trong dung dịch [8]..........................................7

Hình 1.6: Kích thƣớc của dendrimer và kích thƣớc các vật chất trong cơ thể [8] .........8

Hình 1.7: Các hình thức mang thuốc của dendrimer [9] ................................................9

Hình 1.8: Cấu trúc thành vách tế bào Eukaryotic [15].................................................11

Hình 1.9: Phƣơng pháp tổng hợp từ trong ra ngoài [16]..............................................12

Hình 1.10: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong [16] .........................................12

Hình 1.11: Phƣơng pháp tổng hợp từ ngoài vào trong hai bƣớc ..................................13

Hình 1.12: Phƣơng pháp tổng hợp tăng lũy thừa hai [16]............................................14

Hình 1.13: Phƣơng pháp tổng hợp trực giao [16].........................................................14

Hình 1.14: Phƣơng pháp tổng hợp với monomer siêu nhóm chức [16].......................15

Hình 1.15: Nồng độ thuốc trong huyết tƣơng ứng với phƣơng pháp sử dụng thuốc: Tiêm

qua tĩnh mạch (a); Uống trực tiếp (b); Thuốc nhả chậm từ chất mang (c) [33].................16

Hình 1.16: Sự hƣớng đích thụ động theo cơ chế EPR [15]..........................................17

Hình 1.17: Dendrimer mang thuốc đƣợc gắn các tác nhân hƣớng đích đến tế bào ung thƣ [37]

.......................................................................................................................................18

Hình 1.18: Quá trình nhập bào của chất mang-thuốc vào tế bào [15].........................19

Hình 1.19: Thành phần cấu trúc của acid folic.............................................................21

Hình 1.20: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM với nhóm alkyl bề mặt [25].............24

Hình 1.21: Cấu trúc hóa học của các dẫn xuất: (a) amino/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (b)

hydroxyl/hexyl dendrimer PAMAM G4.0; (c) glucosamine/hexyl dendrimer PAMAM G4.0 [73]

.......................................................................................................................................25

Hình 1.22: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM (G5.0-FITC-Folate)Ac [76]

.......................................................................................................................................25

Hình 1.23: Cấu trúc hóa học của dendrime PAMAM G4.0-FA-PEG4000 [47]..........27

Hình 1.24:Sơ đồ phản ứng tổng hợp dendrimer PAMAMG5-Ac(96)-FA-PhiPhiLux G1D2 [78] 28

Hình 2.1: Phổ 1H-NMR của dendrimer PAMAM G3.0 ...............................................43

Hình 2. 2: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C10 .......................46

Hình 3.1: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G-0.5 ..............73

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.0 ...............73

Hình 3.3: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G0.5 ...............74

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.0 ...............75

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G1.5 ...............75

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.0 ...............76

Hình 3.7: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G2.5 ...............77

Hình 3.8: Phổ 1H-NMR và cấu trúc phân tử của dendrimer PAMAM G3.0 ...............78

x

Hình 3.9: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z

...................................84

Hình 3.10: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-C10-36h (G3.0-C10)

.......................................................................................................................................87

Hình 3.11: Cấu trúc sản phẩm G3.0-(NH-CO-CH2(CH2)nCH3)z

.................................91

Hình 3.12: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-alcohol ................................95

Hình 3.13: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G2.5-alkylamine ..........................99

Hình 3.14: Cấu trúc sản phẩm dendrimer PAMAM G 3.0-FA ..................................105

Hình 3.15: Phổ 1H-NMR của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0-FA ....................106

Hình 3.16: Cấu trúc dẫn xuất dendrimer PAMAM G 3.0-C6-FA..............................109

Hình 3.17: Phổ của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-C6-FA................................109

Hình 3.18: Kết quả phân tích bằng kính hiển vi laser quét đồng tiêu ........................114

Hình 3.19: Kết quả TEM của Dendrimer PAMAM G3.0 và dẫn xuất dendrimer

PAMAM G3.0-C6 .......................................................................................................116

Hình 3.20: Kết quả TEM của dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA và G3.0-C6-FA

.....................................................................................................................................116

Hình 3.21: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dendrimer PAMAM G3.0.....118

Hình 3.22: Sắc kí đồ của 5-FU không nang hóa trong dẫn xuất dendrimer PAMAM

G3.0-C6-FA.................................................................................................................118

xi

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1: Kết quả khảo sát thời gian biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với decanoyl chloride

.......................................................................................................................................88

Đồ thị 3. 2: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acetyl chloride (G3.0-C2),

hexanoyl chloride (G3.0-C6), decanoyl chloride (G3.0-C10), myristoyl chloride (G3.0-C14)

.......................................................................................................................................91

Đồ thị 3.3 Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid acetic (G3.0-C2-EDC), acid

hexanoic (G3.0-C6-EDC), acid decanoic (G3.0-C10-EDC), acid myristic (G3.0-C14-EDC)..95

Đồ thị 3.4: Kết quả biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với etanol (G3.0-C2-NPC),

hexanol (G3.0-C6-NPC), octanol (G3.0-C8-NPC), dodecanol (G3.0-C12-NPC)........98

Đồ thị 3.5: Kết quả khảo sát biến tính PAMAM G2.5 với dodecylamine theo nhiệt độ

.....................................................................................................................................102

Đồ thị 3.6: Kết quả biến tính PAMAM G2.5 với alkylamine ....................................104

Đồ thị 3.7: Kết quả thử độc tế bào của PAMAM G3.0; PAMAM G3.0-C2 và

PAMAM G3.0-C14 trên tế bào MCF-7 ......................................................................112

Đồ thị 3.8: Đồ thị biểu hiện lƣợng thuốc đƣợc giải phóng của G3-C6-FA/5FU và 5-FU tự do

.....................................................................................................................................119

xii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng hợp dendrimer PAMAM lõi etylendiamin từ thế hệ G-0.5 đến G3.0

.......................................................................................................................................35

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride ......................37

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..................37

Sơ đồ 2.4: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol ...............................38

Sơ đồ 2.5: Các biến đổi không mong muốn của chất hoạt hóa NPC [34]....................38

Sơ đồ 2.6: Sơ đồ biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với alkylamine .........................39

Sơ đồ 2.7: Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất dendrimer PAMAM G3.0-FA.............................39

Sơ đồ 2.8: Các sản phẩm không mong muốn của phản ứng biến tính dendrimer

PAMAM G3.0 với acid folic.........................................................................................40

Sơ đồ 2.9: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G-0.5...........................................51

Sơ đồ 2.10: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.0..........................................52

Sơ đồ 2.11: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G0.5..........................................53

Sơ đồ 2.12: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G2.5..........................................55

Sơ đồ 2.13: Quy trình tổng hợp dendrimer PAMAM G3.0..........................................56

Sơ đồ 2.14: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acyl chloride..............57

Sơ đồ 2.15: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với acid carboxylic ..........60

Sơ đồ 2.16: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với alcohol.......................62

Sơ đồ 2.17: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G2.5 với amine .........................64

Sơ đồ 2.18: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với FA..............................66

Sơ đồ 2.19: Quy trình biến tính dendrimer PAMAM G3.0 với hecxanoyl chloride và FA

.......................................................................................................................................67

Sơ đồ 2.20: Quy trình nang hóa thuốc 5-FU của dendrimer PAMAM ........................69

Sơ đồ 2.21: Quy trình nhả thuốc 5-FU của dendrimer-5FU.........................................70

xiii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Ac Acetyl

ADN Acid Deoxyribonucleic

BDA Butylene Diamine

PBS Phosphate buffer saline

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DCC Dicyclohexylcarbodiimide

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMF Dimethyleformamide

DMSO Dimethyl Sulfoxide

EDA Ethylendiamine

EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

EPR Enhanced Permeability And Retention Effect

5-FU 5-Flurouracil

FA Acid folic

FAR Folate Receptor

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer

G Thế hệ (Generation)

GPC Gel Permeation Chromatography

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

H Hiệu suất phản ứng

HER-2 Human Epidermal Growth Factor Receptor

HPLC High-Performance Liquid Chromatography

LC-MS Liquid chromatography-mass spectrometry

MA Methyl acrylate

MPEG Methoxy polyethylen glycol

MS Mass Spectroscopy

MRI Magnetic Resonance Imaging