Nghiên cứu tiêu chuẩn hoá dược liệu bằng sắc ký lỏng cao áp với kỹ thuật điểm chỉ vân tay (HPLC-Fingerprint Technique)

1

Bé Y TÕ

_____________________________________________________

B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Ò tµi cÊp Bé

Tªn ®Ò tµi:

Nghiªn cøu tiªu chuÈn hãa d−îc liÖu

b»ng s¾c ký láng cao ¸p víi kü thuËt ®iÓm chØ v©n tay

(HPLC-Finger print Technique)

Chñ nhiÖm ®Ò tµi: TS. NguyÔn ThÞ BÝch Thu

C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn Dîc liÖu- Bé YtÕ

6358

24/4/2007

Hµ Néi – 2006

2

PhÇn A- TãM T¾T C¸C KÕT QU¶ NæI BËT CñA §Ò Tµi

1. KÕt qu¶ næi bËt cña ®Ò tµi:

a) §ãng gãp míi cña ®Ò tµi:

1/Thu thËp d−îc liÖu vµ thÈm ®Þnh chÝnh x¸c tªn khoa häc, ®óng bé phËn

dïng cña 10 d−îc liÖu chuÈn vµ mét sè d−îc liÖu so s¸nh.

2/ X©y dùng qui tr×nh chiÕt nhãm ho¹t chÊt ®Æc tr−ng thÝch hîp cho tõng

d−îc liÖu, æn ®Þnh, ®¬n gi¶n vµ dÔ ¸p dông ë c¸c c¬ së chuyªn ngµnh.

3/ X©y dùng ®−îc ch−¬ng tr×nh SKLCA, kü thuËt SKLCA kÕt hîp dÊu v©n

tay (FPT) ®èi víi c¸c d−îc liÖu nghiªn cøu.

4/ X©y dùng bé d÷ liÖu dÊu v©n tay SKLCA cña 10 d−îc liÖu vµ øng dông

kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Ó b−íc ®Çu kiÓm tra chÊt l−îng vµ ph©n biÖt d−îc liÖu trªn

thÞ tr−êng.

b) KÕt qu¶ cô thÓ:

Qua nghiªn cøu kh¶o s¸t gÇn mét tr¨m mÉu cña 10 d−îc liÖu chuÈn, bao

gåm: cóc hoa (Chrysanthemum indicum L.), h¹ kh« th¶o (Prunella vulgaris L.),

hoµng cÇm (Scutellaria baicalensis Georgi), sinh ®Þa (Rehmannia glutinosa

Libosch), ngò gia b× gai (Acanthopanax trifoliatus L. Merr), ngò gia b× h−¬ng (A.

gracilistylus W.W.Smith), sµi hå (Buplerum chinense DC.), « ®Çu (Aconitum

carmichaeli Debx), tam thÊt (Panax notoginseng Burk. F.H Chen), mËt gÊu (Fel

ursi) vµ mét sè d−îc liÖu dÔ nhÇm lÉn kh¸c trªn thÞ tr−êng, ®Ò tµi ®· thu ®−îc

mét sè kÕt qu¶ sau:

1. X©y dùng c¸c qui tr×nh chiÕt vµ ®iÒu kiÖn ph©n tÝch SKLCA ®Ó x¸c ®Þnh

DVT SKLCA vµ c¸c chÊt ®Æc tr−ng cña tõng d−îc liÖu.

2. X©y dùng d÷ liÖu “DÊu v©n tay SKLCA” cho 10 d−îc liÖu (®· x¸c ®Þnh

chÝnh x¸c tªn khoa häc) bao gåm c¸c s¾c ký ®å, thêi gian l−u vµ phæ UV-VIS cña

c¸c thµnh phÇn hãa häc ®Æc tr−ng (dÞch chiÕt toµn phÇn, nhãm ho¹t chÊt, hoÆc

nhãm chÊt hãa häc ®Æc tr−ng).

3

3. Tõ ®ã, x©y dùng qui tr×nh bao gåm 4 b−íc ®Ó x¸c ®Þnh “DÊu v©n tay

SKLCA” cña d−îc liÖu.

4. øng dông “DÊu v©n tay-SKLCA” ®· x©y dùng cña d−îc liÖu chuÈn ®Ó

kiÓm tra, ®¸nh gi¸ chÊt l−îng d−îc liÖu vµ ph©n biÖt mét sè d−îc liÖu dÔ nhÇm

lÉn cã trªn thÞ tr−êng, nh− c¸c d−îc liÖu mang tªn sµi hå (sµi hå b¾c, løc, cóc

tÇn), tam thÊt (tam thÊt b¾c, tam thÊt nam), mËt gÊu vµ mét sè mËt ®éng vËt

kh¸c, gãp phÇn hiÖn ®¹i hãa vµ quèc tÕ hãa tiªu chuÈn d−îc liÖu vµ thuèc cã

nguån gèc tõ d−îc liÖu.

c) HiÖu qu¶ vÒ ®µo t¹o:

- Båi d−ìng mét sè c¸n bé míi ra tr−êng th«ng qua c¸c néi dung nghiªn

cøu cña ®Ò tµi.

- Gãp phÇn ®µo t¹o:

+ LuËn ¸n tiÕn sÜ Sinh häc cña th¹c sÜ Ph¹m Thanh HuyÒn (Khoa

Tµi nguyªn c©y thuèc): phÇn nghiªn cøu “dÊu v©n tay SKLCA” cña ngò gia b× gai

vµ ngò gia b× h−¬ng.

+ LuËn v¨n d−îc sÜ ®¹i häc cña NguyÔn Thanh T©n (5/2005): Kh¶o s¸t

thµnh phÇn hãa häc cña mËt gÊu vµ mét sè mËt ®éng vËt kh¸c cã thÓ gi¶ m¹o víi

mËt gÊu.

+§µo t¹o mét sè thùc tËp sinh Cuba trong viÖc x©y dùng DVT SKLCA

cña flavonoid toµn phÇn cho mét sè d−îc liÖu.

d) HiÖu qu¶ vÒ kinh tÕ:

§Ò tµi ®· ®ãng gãp t− liÖu DVT SKLCA ®Ó cã thÓ ¸p dông thùc tiÔn trong

tiªu chuÈn hãa vµ kiÓm nghiÖm d−îc liÖu.

e)HiÖu qu¶ vÒ x· héi:

- Tham gia b¸o c¸o khoa häc t¹i Héi nghÞ D−îc §«ng D−¬ng (10/2005):

“Quality control of bear bile”.

4

- B¸o c¸o khoa häc t¹i Héi nghÞ khoa häc ViÖn D−îc liÖu (5/2006): “DÊu

v©n tay SKLCA phôc vô c«ng t¸c tiªu chuÈn hãa d−îc liÖu”

f) C¸c hiÖu qu¶ kh¸c:

Sö dông c¸c ph−¬ng ph¸p vµ kü thuËt DVT SKLCA ®· x©y dùng trong c«ng

t¸c tiªu chuÈn hãa, còng nh− kiÓm tra chÊt l−îng, x¸c ®Þnh chÝnh x¸c d−îc liÖu,

chèng nhÇm lÉn trong sö dông d−îc liÖu.

KÕt qu¶ thu ®−îc vÒ nghiªn cøu ¸p dông DVT SKLCA trong x©y dùng tiªu

chuÈn vµ kiÓm tra chÊt l−îng d−îc liÖu sÏ ®−îc øng dông trong viÖc hiÖn ®¹i hãa

tiªu chuÈn d−îc liÖu vµ thuèc cã nguån gèc tõ d−îc liÖu.

Phôc vô cho viÖc x©y dùng mét sè chuyªn luËn vÒ d−îc liÖu cña D−îc ®iÓn

IV.

2. ¸p dông vµo thùc tiÔn s¶n xuÊt vµ ®êi sèng x· héi:

KÕt qu¶ thu ®−îc cña ®Ò tµi vÒ kü thuËt DVT SKLCA ®· vµ ®ang ®−îc ¸p

dông trong c«ng t¸c ph©n tÝch thµnh phÇn hãa häc ®Æc tr−ng vµ tiªu chuÈn ho¸

d−îc liÖu b»ng ph−¬ng ph¸p SKLCA.

3. §¸nh gi¸ thùc hiÖn ®Ò tµi ®èi chiÕu víi ®Ò c−¬ng nghiªn cøu ®· ®−îc phª

duyÖt:

a/TiÕn ®é: §Ò tµi thùc hiÖn chËm h¬n so víi tiÕn ®é ®Ò ra (§· cã ®¬n xin

phÐp).

b/Thùc hiÖn môc tiªu nghiªn cøu: §Ò tµi ®· thùc hiÖn ®óng môc tiªu ®Ò ra:

- ¸p dông DVT SKLCA ®Ó gãp phÇn tiªu chuÈn hãa mét sè d−îc liÖu

ViÖt Nam.

- X©y dùng bé d÷ liÖu DVT SKLCA cho mét sè d−îc liÖu ViÖt Nam.

- C¸c kü thuËt nghiªn cøu cã thÓ ¸p dông cho viÖc x©y dùng tiªu chuÈn

ViÖt Nam cña D−îc ®iÓn ViÖt Nam IV.

- Ph¸t triÓn hÖ thèng SKLCA nghiªn cøu ®Þnh tÝnh, ®Þnh l−îng c¸c

thµnh phÇn hãa häc ®Æc tr−ng trong mét sè c©y thuèc ë ViÖt Nam.

5

c/ C¸c s¶n phÈm t¹o ra so víi dù kiÕn cña ®Ò c−¬ng: S¶n phÈm cña ®Ò tµi

thu ®−îc theo ®óng dù kiÕn.

Ngoµi ra, mét sè s¾c ký ®å “dÊu v©n tay” ®· ®−îc ®èi chiÕu víi “chÊt ®¸nh

dÊu” lµ c¸c chÊt ®Æc tr−ng (thµnh phÇn chÝnh hoÆc ho¹t chÊt), ®iÒu ®ã lµm t¨ng

®é tin cËy cña kÕt qu¶ nghiªn cøu so víi ®Ò c−¬ng ®Ò ra. ThÝ dô: chÊt ®èi chiÕu

Rg1 vµ Rb1 trong tam thÊt, catalpol trong sinh ®Þa- thôc ®Þa, TUDC vµ TCDC

trong mËt gÊu…

d/ §¸nh gi¸ viÖc sö dông kinh phÝ:

- Tæng kinh phÝ thùc hiÖn ®Ò tµi: 150 triÖu ®ång

- Trong ®ã, kinh phÝ sù nghiÖp khoa häc: 150 triÖu ®ång

- Kinh phÝ tõ nguån kh¸c: kh«ng

- Toµn bé kinh phÝ ®· ®−îc quyÕt to¸n.

4. C¸c ý kiÕn ®Ò xuÊt:

- Trªn c¬ së qui tr×nh x¸c ®Þnh DVT- SKLCA cña ®Ò tµi ®· b−íc ®Çu x©y

dùng, cã thÓ tiÕp tôc nghiªn cøu ¸p dông trªn nhiÒu d−îc liÖu kh¸c vµ c¸c chÕ

phÈm thuèc tõ d−îc liÖu.

- Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®−îc cña mét sè ®Ò tµi vÒ d−îc liÖu chuÈn vµ x©y dùng d÷

liÖu “dÊu v©n tay hãa häc”, ®Ò nghÞ Héi ®ång d−îc ®iÓn cã kÕ ho¹ch rµ so¹t l¹i vµ

hiÖn ®¹i hãa c¸c tiªu chuÈn kiÓm tra, ®¸nh gi¸ d−îc liÖu vµ x©y dùng tiªu chuÈn

d−îc liÖu.

-Bé YtÕ cÇn cã kÕ ho¹ch nhanh chãng ¸p dông c¸c ph−¬ng ph¸p c«ng cô hiÖn

®¹i trong viÖc x©y dùng tiªu chuÈn vµ kiÓm tra chÊt l−îng d−îc liÖu vµ c¸c chÕ

phÈm tõ d−îc liÖu.

6

PHÇN B- NéI DUNG

1. §Æt vÊn ®Ò

Tiªu chuÈn hãa vµ kiÓm tra chÊt l−îng thuèc cã nguån gèc th¶o méc lµ viÖc

cÇn quan t©m. KiÓm tra chÆt chÏ nguån nguyªn liÖu ban ®Çu lµ yÕu tè sèng cßn

®Ó ®¶m b¶o hiÖu lùc vµ t¸c dông cña thuèc th¶o méc.

Tr−íc kia, c¸c chuyªn luËn vÒ d−îc liÖu trong c¸c D−îc ®iÓn cña nhiÒu

quèc gia trªn thÕ giíi th−êng qui ®Þnh tiÕn hµnh ®Þnh tÝnh c¸c thµnh phÇn hãa häc

®Æc tr−ng trong c©y b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng (SKLM). Nh−ng tõ

nh÷ng n¨m cuèi cña thÕ kû 20, víi tiÕn bé v−ît bËc cña khoa häc kü thuËt, kÕt

hîp c¸c ph−¬ng ph¸p ph©n tÝch c«ng cô trong ph©n tÝch ®Þnh tÝnh, ®Þnh l−îng c¸c

nhãm chÊt hãa häc ®Æc tr−ng ®· trë nªn ngµy cµng quen thuéc vµ cã hiÖu qu¶

trong ®¸nh gi¸, kiÓm tra chÊt l−îng thuèc, ®Æc biÖt thuèc cã nguån gèc th¶o méc.

Kü thuËt “DÊu v©n tay” (DVT) lµ mét ph−¬ng ph¸p ghi c¸c th«ng tin hãa

häc cña d−îc liÖu vµ chÕ phÈm víi c¸c s¾c ký ®å, c¸c phæ vµ c¸c ®å thÞ kh¸c

b»ng c¸c kü thuËt ph©n tÝch hãa häc.

Cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p thu nhËn “dÊu v©n tay”: s¾c ký, phæ tö ngo¹i, phæ

hång ngo¹i, phæ céng h−ëng tõ h¹t nh©n vµ khèi phæ… Mçi kü thuËt cung cÊp

mét phÇn c¸c ®Æc ®iÓm hãa häc dùa vµo nh÷ng thµnh phÇn chÝnh cña thuèc. V×

vËy, dÊu v©n tay cã thÓ bao gåm nhiÒu ®å thÞ, s¾c ®å, phæ… C¸c ph−¬ng ph¸p lÊy

dÊu v©n tay b»ng phæ UV, IR, NMR vµ MS cã nh÷ng h¹n chÕ nhÊt ®Þnh. ChÝnh v×

thÕ, c¸c ph−¬ng ph¸p s¾c ký, bao gåm SKLM, SKLCA, s¾c ký khÝ th−êng ®−îc

¸p dông khi nghiªn cøu dÊu v©n tay [20, 21, 24, 27].

ë Trung Quèc, Ên §é, viÖc kiÓm tra chÊt l−îng thuèc y häc cæ truyÒn ®·

®−îc hiÖn ®¹i hãa vµ quèc tÕ hãa, ®Æc biÖt trong kü thuËt s¾c ký x¸c ®Þnh “dÊu

v©n tay” [28, 29].

Ngµy cµng cã nhiÒu n−íc trªn thÕ giíi yªu cÇu thiÕt lËp m« h×nh DVT trong

tiªu chuÈn ho¸ vµ kiÓm tra chÊt l−îng c¸c thuèc tõ d−îc liÖu. Trong t−¬ng lai rÊt

7

gÇn, DVT s¾c ký sÏ trë nªn phæ biÕn trong viÖc tiªu chuÈn ho¸ vµ kiÓm tra chÊt

l−îng d−îc liÖu vµ thuèc tõ th¶o méc.

Cho tíi nay, ë ViÖt Nam c¸c c«ng tr×nh ®· c«ng bè vÒ nghiªn cøu kü thuËt

x¸c ®Þnh "dÊu v©n tay SKLCA" cña c¸c d−îc liÖu vµ chÕ phÈm tõ d−îc liÖu cßn

rÊt Ýt.

Nh− vËy, nghiªn cøu x©y dùng ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh “dÊu v©n tay” cña

d−îc liÖu “chuÈn”, ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt l−îng d−îc liÖu vµ ph©n biÖt víi c¸c d−îc

liÖu “gi¶” trªn thÞ tr−êng, lµ viÖc lµm cÇn thiÕt, lµ yªu cÇu cña thùc tÕ, ®Ó gãp

phÇn hiÖn ®¹i hãa vµ quèc tÕ hãa tiªu chuÈn d−îc liÖu vµ thuèc cã nguån gèc tõ

d−îc liÖu, còng nh− x¸c ®Þnh gi¶ m¹o, chèng nhÇm lÉn trong sö dông vµ bµo chÕ

thuèc tõ d−îc liÖu.

Trªn thÕ giíi, SKLCA ®−îc coi lµ c«ng cô ph©n tÝch rÊt hiÖu qu¶ nhiÒu nhãm

chÊt hãa häc. ë ViÖt Nam, nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ®iÒu kiÖn trang thiÕt bÞ ph©n tÝch

ngµy cµng hiÖn ®¹i, viÖc øng dông SKLCA trong ph©n tÝch ®· cã nhiÒu tiÕn bé,

nhÊt lµ trong viÖc kiÓm tra ®¸nh gi¸ chÊt l−îng thuèc t©n d−îc. V× vËy, nghiªn

cøu triÓn khai SKLCA trong ph©n tÝch ®Þnh tÝnh c¸c thµnh phÇn trong d−îc liÖu

nh»m tiªu chuÈn hãa d−îc liÖu b»ng kü thuËt ®iÓm chØ v©n tay lµ mét c«ng viÖc

cÇn thiÕt vµ cã ý nghÜa.

Chóng t«i tiÕn hµnh thùc hiÖn ®Ò tµi: “Nghiªn cøu tiªu chuÈn hãa d−îc liÖu

b»ng s¾c ký láng cao ¸p víi kü thuËt ®iÓm chØ v©n tay (HPLC-Fingerprint

Technique)” víi c¸c môc ®Ých sau:

1. ¸p dông HPLC-FPT ®Ó gãp phÇn tiªu chuÈn hãa 1 sè d−îc liÖu ViÖt Nam

2. X©y dùng bé d÷ liÖu HPLC-FPT cho mét sè d−îc liÖu ViÖt Nam.

3. C¸c kü thuËt nghiªn cøu cã thÓ ¸p dông cho viÖc x©y dùng tiªu chuÈn ViÖt

Nam cña D−îc ®iÓn ViÖt Nam IV.

4. Ph¸t triÓn hÖ thèng s¾c ký láng cao ¸p nghiªn cøu ®Þnh tÝnh, ®Þnh l−îng c¸c

thµnh phÇn hãa häc ®Æc tr−ng trong mét sè c©y thuèc ë ViÖt Nam.

8

2. Tæng quan

2.1. DÊu v©n tay, dÊu v©n tay hãa häc vµ dÊu v©n tay SKLCA cña d−îc liÖu vµ

chÕ phÈm thuèc tõ d−îc liÖu:

ChÊt l−îng vµ thµnh phÇn hãa häc cña d−îc liÖu thay ®æi phô thuéc nhiÒu

yÕu tè, nh− loµi, nguån gèc ®Þa lý, ®iÒu kiÖn trång trät, thu h¸i, b¶o qu¶n vµ chÕ

biÕn… V× vËy, cÇn thiÕt ph¶i cã c¸c ph−¬ng ph¸p khoa häc ®Ó ®¸nh gi¸ vµ kiÓm

tra chÊt l−îng d−îc liÖu vµ thuèc th¶o méc. GÇn ®©y, trong sè c¸c ph−¬ng ph¸p

®¸nh gi¸ chÊt l−îng cña d−îc liÖu vµ thuèc th¶o méc th× ph−¬ng ph¸p dÊu v©n tay

s¾c ký thu hót ®−îc sù quan t©m cña nhiÒu nhµ khoa häc [18, 22, 69, 70].

DVT lµ mét kh¸i niÖm réng. Cã thÓ dïng nhiÒu ®Æc ®iÓm ®Æc tr−ng cña

d−îc liÖu ®Ó x¸c ®Þnh DVT, nh− DVT ADN, DVT hãa häc…DVT s¾c ký lµ c¸c

s¾c ký ®å giíi thiÖu c¸c ®Æc tr−ng hãa häc cña d−îc liÖu vµ chÕ phÈm thuèc th¶o

méc. Nãi chung, c¸c mÉu cã DVT s¾c ký gièng nhau th× cã tÝnh chÊt gièng nhau.

NhiÒu tµi liÖu vÒ DVT s¾c ký cña d−îc liÖu vµ thuèc th¶o méc ®· ®−îc c«ng bè,

nh− b¹ch qu¶ (Ginkgo biloba), ®an s©m (Salvia miltiorrhiza Bunge.), hoµng cÇm

(Scutellaria baicalensis), sµi hå (Buplerum chinense DC.), tam thÊt (Panax

notoginseng Burk. F.H Chen)…[10, 12, 14, 15, 25, 46, 49, 64, 74, 78].

Cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p kh¸c nhau ®−îc ¸p dông ®Ó x©y dùng DVT hãa häc:

SKLM, SKLCA víi detector chuçi diod (DAD), s¾c ký ®iÖn di –DAD, GC-MS,

LC-MS, kÕt hîp s¾c ký víi c¸c kü thuËt quang phæ nh− FT-IR, NIR, NMR……

C¸c ph−¬ng ph¸p nµy cã −u ®iÓm v−ît tréi lµ chÝnh x¸c, chän läc vµ cã thÓ cho

c¸c th«ng tin vÒ cÊu tróc hãa häc on- line (phæ UV-VIS, phæ khèi…). [21, 71,

75].

ThiÕt lËp m« h×nh DVT (æn ®Þnh vµ thèng nhÊt) lµ mét b−íc quan träng ®Ó

c¶i thiÖn chÊt l−îng cña thuèc tõ d−îc liÖu vµ ®−îc tæ chøc Y tÕ thÕ giíi (WHO),

c¬ quan an toµn thùc phÈm vµ d−îc phÈm Mü (FDA), c¬ quan qu¶n lý thuèc

ch©u ¢u (EMEA) giíi thiÖu réng r·i. N¨m 2005, WHO ®· h−íng dÉn vÒ tiªu

9

chuÈn ho¸ c¸c thuèc tõ d−îc liÖu, bao gåm nhiÒu b−íc, mét trong c¸c b−íc ®ã lµ

“¸p dông c¸c ph−¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ vÒ s¾c ký vµ quang phæ... ChÊt l−îng cña

thuèc cã thÓ ®−îc ®¸nh gi¸ dùa vµo DVT s¾c ký” [24, 27, 28, 29, 34, 59, 60, 69,

70, 71].

C¬ quan an toµn thùc phÈm vµ d−îc phÈm Trung Quèc coi thiÕt lËp DVT lµ

mét giai ®o¹n quan träng ®Ó kiÓm tra chÊt l−îng vµ hiÖn ®¹i hãa thuèc y häc cæ

truyÒn vµ qui ®Þnh kiÓm tra thuèc tiªm tõ th¶o méc b»ng ph−¬ng ph¸p DVT [61].

ë §øc vµ mét sè n−íc ch©u ¢u, theo h−íng dÉn cña héi c¸c liªn ®oµn s¶n

xuÊt D−îc (IFPMA) ®èi víi ph−¬ng ph¸p tiªu chuÈn hãa c¸c thuèc tõ th¶o méc,

khi ho¹t chÊt míi chØ biÕt mét phÇn hoÆc chÕ phÈm chøa nhiÒu thµnh phÇn th« th×

ph−¬ng ph¸p thÝch hîp nhÊt lµ thu s¾c ký "dÊu v©n tay" cña chÕ phÈm b»ng

ph−¬ng ph¸p SKLCA, hoÆc SKLM. ë ý, l¸ B¹ch qu¶ (Ginkgo biloba) ®−îc kiÓm

tra 5 nhãm hîp chÊt kh¸c nhau liªn quan tíi t¸c dông cña thuèc, lµ flavonoid,

diterpen, sesquiterpen, proanthocyanidin vµ ginkgol. S¾c ký "dÊu v©n tay" cña

c¸c nhãm chÊt nµy thu ®−îc b»ng c¸c kü thuËt s¾c ký kÕt hîp víi quang phæ, nh−

SKLCA (c¸c ginkgol, flavonoid, proanthocyanidin), GC-MS (terpene,

sesquiterpen)... Trong tr−êng hîp chÕ phÈm thuèc gåm nhiÒu d−îc liÖu, h−íng

nghiªn cøu hiÖn nay lµ x¸c ®Þnh c¸c ®Æc ®iÓm ®Æc tr−ng cña tõng thµnh phÇn

trong c«ng thøc vµ dïng nã ®Ó x¸c ®Þnh “dÊu v©n tay tæng hîp” cña chÕ phÈm

thuèc [13, 14, 41, 50].

Th¸ng 8/2000, trong “H−íng dÉn s¶n xuÊt c¸c thuèc tõ d−îc liÖu”, c¬ quan

an toµn vÒ thùc phÈm vµ d−îc phÈm Mü (FDA) kh¼ng ®Þnh yªu cÇu ph¶i cung

cÊp c¸c d÷ liÖu vÒ dÊu v©n tay s¾c ký cña s¶n phÈm thuèc [18].

SKLCA lµ mét trong c¸c kü thuËt s¾c ký chung nhÊt ®Ó x¸c ®Þnh DVT cña

d−îc liÖu vµ chÕ phÈm thuèc th¶o méc do röa gi¶i tèt, ®é lÆp l¹i cao vµ cã tÝnh

kh¶ thi nhÊt vµ th−êng ®−îc ¸p dông [25, 69].

10

ë Ên §é, viÖc kÕt hîp c¸c ph−¬ng ph¸p c«ng cô, nh− SKLM, SKLM hiÖu

n¨ng cao, SKLCA, SKK, NMR, MS....®Ó cung cÊp "dÊu v©n tay " cña c¸c chÊt tù

nhiªn cã trong c©y, nh»m x¸c ®Þnh chÝnh x¸c d−îc liÖu, còng nh− ®Ó tiªu chuÈn

hãa chÕ phÈm tõ d−îc liÖu ®−îc ®Æc biÖt quan t©m. N¨m 2003, t¸c gi¶ A. K.

Gupta ®· xuÊt b¶n s¸ch “Tiªu chuÈn hãa chÊt l−îng c¸c c©y thuèc Ên §é” gåm

32 chuyªn luËn vÒ d−îc liÖu, trong ®ã mçi chuyªn luËn ®Òu giíi thiÖu vÒ kü thuËt

dÊu v©n tay s¾c ký (SKLM, SKLCA hoÆc SKK). ViÖn C«ng nghÖ hãa häc Ên §é

ngµy 18/6/2003 tuyªn bè ®· ph¸t triÓn ph−¬ng ph¸p "dÊu v©n tay SKLCA" ®Ó

tiªu chuÈn hãa c¸c thuèc y häc cæ truyÒn, còng nh− gi¶i thÝch t¸c dông cña chóng

trªn c¬ së d÷ liÖu cña c¸c "dÊu v©n tay SKLCA" ®−îc ph¸t hiÖn ®èi víi tÊt c¶ c¸c

c©y thuèc cña Ên §é. Ph¸t hiÖn nµy gióp c¸c nhµ s¶n xuÊt d−îc phÈm b¶o vÖ

®−îc b¶n quyÒn cña chÕ phÈm thuèc y häc cæ truyÒn trªn c¬ së "m· sè m· v¹ch"

dÊu v©n tay SKLCA cña c¸c d−îc liÖu [15, 52, 54].

§«i khi DVT s¾c ký thu ®−îc khi ph©n tÝch cïng mét mÉu víi cïng ®iÒu

kiÖn ph©n tÝch cã sù thay ®æi vÒ chiÒu cao (diÖn tÝch) vµ thêi gian l−u cña pic.

HiÖn nay ë Trung Quèc vµ mét sè n−íc kh¸c trªn thÕ giíi, ph−¬ng ph¸p s¾c ký

hiÖu chØnh phæ (Spectral correlative chromatography – SCC) ®−îc coi lµ mét

ph−¬ng ph¸p h÷u hiÖu ®Ó gi¶i quyÕt vÊn ®Ò thay ®æi thêi gian l−u cña pic trong

s¾c ký ®å [11, 26, 61].

CRF (Chromatographic response function), cßn gäi lµ “fingerprint index”

còng ®−îc dïng ®Ó so s¸nh mét c¸ch ®Þnh l−îng DVT SKLCA thu ®−îc ë nh÷ng

®iÒu kiÖn ph©n tÝch kh¸c nhau vµ x¸c ®Þnh nh÷ng ®iÒu kiÖn tèi −u ®Ó x©y dùng

s¾c ký ®å DVT ®Æc tr−ng [61].

Ph©n tÝch thµnh phÇn hãa häc cña c¸c loµi c©y kh¸c nhau b»ng ph−¬ng ph¸p

SKLCA cho "dÊu v©n tay SKLCA" ®Æc tr−ng ®èi víi mçi loµi. C¬ së míi cña

ph−¬ng ph¸p lµ bé phËn ph¸t hiÖn detector chuçi diod, tÝnh chÊt phæ cña c¸c

thµnh phÇn hãa häc ®−îc biÓu thÞ ë s¾c ký ®å kh«ng gian 3 chiÒu...[12].

11

Detector chuçi diod ®−îc ¸p dông réng r·i ®Ó x¸c ®Þnh ®ång thêi s¾c ký ®å

vµ phæ UV-VIS cña c¸c pic s¾c ký, dÔ dµng ®Þnh tÝnh c¸c chÊt vµ cã th«ng tin s¾c

ký ë c¸c b−íc sãng kh¸c nhau … Trong giai ®o¹n hiÖn nay, SKLCA-DAD lµ mét

c«ng cô t−¬ng ®èi phæ biÕn, tá ra cã nhiÒu ý nghÜa thiÕt thùc trong viÖc x¸c ®Þnh

DVT d−îc liÖu phôc vô c«ng t¸c tiªu chuÈn hãa vµ kiÓm tra chÊt l−îng d−îc liÖu

vµ thuèc th¶o méc.

D§TQ tõ 1985 – 2000 ®· 4 lÇn xuÊt b¶n. C¸c ph−¬ng ph¸p míi ®−îc ¸p dông

cho kiÓm nghiÖm d−îc liÖu lµ: TLC (1985), HPLC, GC, TLCS (1990). §Õn

D§TQ n¨m 2000 ®· cã 105 loµi ®−îc kiÓm nghiÖm b»ng HPLC, 60 loµi b»ng

ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng quÐt phæ vµ 11 loµi b»ng ph−¬ng ph¸p GC. D§TQ

2005 ®−a vµo nh÷ng ph−¬ng ph¸p kiÓm nghiÖm hiÖn ®¹i, nh− ph−¬ng ph¸p sinh

häc ph©n tö – dÊu v©n tay DNA vµ ph−¬ng ph¸p dÊu v©n tay hãa häc. Trong ®ã

dÊu v©n tay hãa häc lµ ph−¬ng ph¸p chñ yÕu [65].

DÊu v©n tay trong kiÓm tra chÊt l−îng d−îc liÖu vµ thuèc th¶o méc: Ph©n tÝch

DVT chØ râ kÕt qu¶ gièng nhau ®−îc tÝnh to¸n dùa trªn c¸c gi¸ trÞ t−¬ng ®èi víi

c¸c hîp chÊt ®−îc chän lµm chÊt ®èi chiÕu, kh«ng cã gi¸ trÞ ®Þnh l−îng tuyÖt ®èi.

HiÖn nay, ph−¬ng ph¸p DVT s¾c ký kÕt hîp ®Þnh l−îng hµm l−îng mét vµi chÊt

®¸nh dÊu th−êng ®−îc ¸p dông ®Ó kiÓm tra chÊt l−îng thuèc y häc cæ truyÒn [45,

70].

ChuÈn bÞ mÉu ph©n tÝch lµ b−íc quan träng nhÊt trong kü thuËt ph©n tÝch

DVT. Tïy theo tõng d−îc liÖu cô thÓ cã c¸c ph−¬ng ph¸p chiÕt t¸ch kh¸c nhau,

ph©n tÝch DVT cña dÞch chiÕt toµn phÇn hoÆc dÞch chiÕt c¸c ph©n ®o¹n, nhãm

chÊt.

Trong n−íc:

VÊn ®Ò æn ®Þnh chÊt l−îng vµ an toµn d−îc liÖu hiÖn ®ang lµ vÊn ®Ò bøc xóc

cña ngµnh D−îc, c¸c nhµ qu¶n lý chÊt l−îng thuèc vµ c¶ ng−êi dïng thuèc. Thùc

tÕ c«ng t¸c qu¶n lý, kiÓm tra chÊt l−îng thuèc cã nguån gèc th¶o méc ë n−íc ta

12

®ang tån t¹i nhiÒu vÊn ®Ò cÇn quan t©m gi¶i quyÕt. ChÊt l−îng, an toµn vµ hiÖu

qu¶ cña thuèc d−îc liÖu ph¶i ®−îc ®¶m b¶o ®Ó cho ng−êi sö dông yªn t©m vµ

t¨ng c−êng c¶i thiÖn s¶n xuÊt vµ kinh doanh c¸c chÕ phÈm thuèc th¶o méc gi÷a

c¸c n−íc trªn thÕ giíi nãi chung vµ c¸c n−íc ë §«ng Nam ch©u ¸ nãi riªng.

YÕu tè quan träng nhÊt ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt l−îng thuèc tõ d−îc liÖu lµ tÝnh æn

®Þnh vµ ®¶m b¶o chÊt l−îng. Theo c¸c ®iÒu tra cho thÊy, nguån d−îc liÖu trong

n−íc cung cÊp cho c¸c c¬ së s¶n xuÊt thuèc ®«ng d−îc ë n−íc ta chØ chiÕm mét

tØ lÖ rÊt Ýt, cßn l¹i ®a phÇn lµ c¸c d−îc liÖu nhËp tõ n−íc ngoµi theo c¸c con ®−êng

tr«i næi. ChÊt l−îng d−îc liÖu hÇu nh− kh«ng ®−îc kiÓm so¸t vµ ®¸nh gi¸ chÆt

chÏ khi mua b¸n vµ sö dông lµm thuèc. Cã nhiÒu nguyªn nh©n, nh−ng viÖc thiÕu

ph−¬ng ph¸p kiÓm tra chÝnh x¸c d−îc liÖu lµ vÊn ®Ò næi cém, dÉn ®Õn dïng d−îc

liÖu chÊt l−îng kÐm, dïng kh«ng ®óng d−îc liÖu, gi¶ m¹o, nhÇm lÉn, hoÆc tïy

tiÖn thay thÕ c¸c vÞ thuèc...

D−îc ®iÓn ViÖt Nam III cã 276 chuyªn luËn d−îc liÖu, 37 chuyªn luËn chÕ

phÈm ®«ng d−îc: th−êng dïng ph¶n øng ®Þnh tÝnh trong èng nghiÖm, hoÆc dïng

chÝnh d−îc liÖu lµm ®èi chiÕu trong ph−¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh b»ng SKLM, hoÆc

nh÷ng chÊt ®èi chiÕu khã kiÕm ë ViÖt Nam. Kh«ng cã ph−¬ng ph¸p ®Þnh tÝnh,

®Þnh l−îng d−îc liÖu b»ng ph−¬ng ph¸p SKLCA.

Cho tíi nay, ë n−íc ta cã rÊt Ýt c«ng tr×nh c«ng bè vÒ nghiªn cøu kü thuËt

x¸c ®Þnh "dÊu v©n tay SKLCA" cña c¸c d−îc liÖu vµ chÕ phÈm tõ d−îc liÖu.

2.2. Tæng quan vÒ thµnh phÇn hãa häc vµ mét sè ph−¬ng ph¸p kiÓm tra chÊt

l−îng cña 10 ®èi t−îng nghiªn cøu:

1)Cóc hoa (Chrysanthemum indicum L.), hä Cóc (Asteraceae): [3, 5, 9, 17, 42,

43, 53, 57, 73].

Cóc hoa vµng chøa c¸c thµnh phÇn:

- Carotenoid (chrysanthemoxanthin)

- Tinh dÇu, trong ®ã cã c¸c monoterpen, dÉn xuÊt oxy cña monoterpen…

13

- Sesquiterpen: angeloyl cumambrin B, arteglasin A, angeloylajadin,

yejuhua lacton, handelin, chrysetunon, tuncfulin, cumambrin A.

- Flavonoid: acaciin, luteolin-7-O-β-D-glucopyranosid, acacetin-7-O-β-D￾galactopyranosid, chrysanthemin.

- Acid amin: adenin, cholin, stachydrin.

- C¸c thµnh phÇn kh¸c gåm: indicumenon, β-sitosterol, α-amyrin, β-amyrin,

friedelin, sesamin, vitamin A, vitamin B1.

D§VN III qui ®Þnh ®Þnh tÝnh flavonoid trong d−îc liÖu b»ng ph¶n øng èng

nghiÖm vµ b»ng SKLM.

2)H¹ kh« th¶o (Prunella vulgaris L.) [3, 5, 9, 55]

Bé phËn dïng: Côm hoa ®· ph¬i hay sÊy kh« cña c©y H¹ kh« th¶o.

H¹ kh« th¶o chøa alcaloid tan trong n−íc, muèi v« c¬ (3,5%), tinh dÇu cã

chøa camphor, D-fechon, alcol fechilic, glucosid ®¾ng prunelin mµ phÇn kh«ng

®−êng lµ acid ursolic. Ngoµi ra cßn cã delphinidin, cyanidin.

ë Ph¸p, ng−êi ta x¸c ®Þnh trong c©y cã nhùa, chÊt ®¾ng, tanin, tinh dÇu, chÊt

bÐo, lypase, mét glucosid tan trong n−íc (0,7g/kg d−îc liÖu kh«) vµ mét acid

saponosid. Ngoµi ra, cßn cã ursan glucosid pruvulosid A vµ B, quercetin,

quercetin-3-glucosid; kempferol-3-0-glucosid …

NhiÒu c«ng tr×nh c«ng bè ®· t¸ch tõ toµn c©y H¹ kh« th¶o acid oleanolic; β￾amyrin; (22E, 22S, 24S) stigmata -7-22-dien-3-on; α-spinasterol; β-sitosterol,

daucosterol…

Thµnh phÇn hãa häc cña tinh dÇu qu¶ ®−îc x¸c ®Þnh b»ng GCMS cã 17

thµnh phÇn, trong ®ã acid hexadecanoic lµ thµnh phÇn chñ yÕu.

D§VN III qui ®Þnh ®Þnh tÝnh d−îc liÖu b»ng ph¶n øng trong èng nghiÖm vµ

b»ng SKLM, so s¸nh víi chÝnh b¶n th©n d−îc liÖu lµm dung dÞch ®èi chiÕu.

14

D−îc §iÓn Trung Quèc qui ®Þnh ®Þnh tÝnh acid ursolic trong d−îc liÖu h¹

kh« th¶o b»ng ph−¬ng ph¸p SKLM [46].

3)Hoµng cÇm (Scutellaria baicalensis Georgi., Lamiaceae.) [3, 5, 9, 46,

74].

Thµnh phÇn hãa häc cña chi Scutellaria bao gåm flavonoid, tinh dÇu,

iridoid, diterpenoid vµ tanin… Nh÷ng c©y ®−îc chó ý nhiÒu trong chi lµ S.

baicalensis, S lateriflora (Scullkap), S. indica vµ S. ikonnikovii … Tõ rÔ Hoµng

cÇm, c¸c t¸c gi¶ Trung Quèc ®· x¸c ®Þnh ®−îc 31 chÊt thuéc nhãm flavon vµ

flavanon, chñ yÕu lµ baicalin, baicalein, scutelarein… Ngoµi ra, cã nhiÒu tanin

nhãm pyrocatechic (2 – 5%) vµ nhùa. Scutellarin cã ë trong l¸ vµ th©n víi hµm

l−îng 8,4 – 10,3%.

Ngoµi ra, trong rÔ cßn cã 12 glucosid. §ã lµ wogonin 5 - β - D glucosid;

chrysin 6 – C - β - D – glucosid – 8 – C - α - L – arabinosid… C¸c chÊt

wogonin vµ skulcapflavon ΙΙ cã trong Hoµng cÇm lµ chÊt cã ho¹t tÝnh sinh häc

®¸ng chó ý.

YÕu tè quan träng nhÊt trong viÖc x¸c ®Þnh chÊt l−îng d−îc liÖu lµ x¸c

®Þnh hµm l−îng cña c¸c chÊt ®−îc coi lµ ho¹t chÊt trong c©y. Flavonoid ®−îc

quan t©m nhiÒu nhÊt khi ®¸nh gi¸ chÊt l−îng d−îc liÖu chi Scutellaria. Ph−¬ng

ph¸p SKLCA ®−îc ¸p dông nhiÒu trong ph©n tÝch ®Þnh tÝnh, ®Þnh l−îng ®ång thêi

nhiÒu flavonoid trong hoµng cÇm.

D§VN III qui ®Þnh ®Þnh tÝnh d−îc liÖu b»ng ph¶n øng trong èng nghiÖm.

§Þnh l−îng flavonoid trong rÔ hoµng cÇm b»ng ph−¬ng ph¸p SKLCA (theo

D§TQ 2000). Hµm l−îng baicalin kh«ng ®−îc thÊp h¬n 9% (hoÆc kh«ng thÊp

h¬n 8% ®èi víi hoµng cÇm chÕ) tÝnh theo d−îc liÖu kh« tuyÖt ®èi.

T¸c gi¶ Ke Yu vµ cs. (2006) ®· ®¸nh gi¸ chÊt l−îng cña hoµng cÇm b»ng

ph−¬ng ph¸p kÕt hîp ph©n tÝch dÊu v©n tay s¾c ký vµ ®Þnh l−îng ba thµnh phÇn

15

chÝnh trong hoµng cÇm lµ baicalin, baicalein vµ wogonin b»ng kü thuËt ®iÖn di

mao qu¶n. Sù kÕt hîp gi÷a ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng mét vµi chÊt ®¸nh dÊu (®−îc

coi lµ ho¹t chÊt) víi dÊu v©n tay s¾c ký ®· gióp cho viÖc ®¸nh gi¸ chÊt l−îng

d−îc liÖu vµ chÕ phÈm thuèc th¶o d−îc mét c¸ch chÝnh x¸c h¬n [74].

4) Sinh ®Þa (Rehmania glutinosa Libosch., Scrophulariaceae).

RÔ cñ §Þa hoµng chøa: [1, 2, 3, 5, 9]

1. Iridoid glycosid: Catalpol (ph©n lËp ®Çu tiªn tõ rÔ cñ t−¬i), rehmanosid A,

rehmanosid B, rehmanosid C, rehmanosid D, ajugol, aucubin, melitosid…

Ngoµi ra cßn cã c¸c iridoid rehmaglutin A, rehmaglutin B, rehmaglutin C,

rehmaglutin D.

2. Ionon glucosid: rehmaionosid A, rehmaionosid B, rehmaionosid C.

3. Carbohydrat gåm D – glucose, D – fructose, sucrose, maniotriose,

rafinose, stachyose, vesbascose, D – manitol.

4. C¸c thµnh phÇn kh¸c: acid amin 0,15 – 6,15% (Ýt nhÊt 15 acid amin tù

do), ester cña acid bÐo 0,01% (methyl linoleat, methyl palmitat, methyl – n

octadecanoat), β - sitosterol, daucosterol, acid palmitic…

D§VN III qui ®Þnh ®Þnh tÝnh d−îc liÖu b»ng SKLM, dïng catalpol lµm chÊt

®èi chiÕu. NÕu kh«ng cã Catalpol th× dïng d−îc liÖu §Þa hoµng lµm ®èi chiÕu.

Catalpol lµ mét glycosid irridoid rÊt khã kiÕm vµ ®¾t tiÒn ë ViÖt Nam.

5) Ngò gia b× gai (Acanthopanax trifoliatus L. Merr., Araliaceae) [9, 19,

32, 33, 36, 56].

Vá rÔ vµ vá th©n Ngò gia b× gai chøa acid 3α, 11α - dihydroxy – 23 – oxylup

– 20 (29) – en – 28 – oic; acid 24 nor - 11α - hydroxy – 3 – oxolup – 20(29) – en

– 28 – oic; acid 24 – nor - 3α, 11α - hydroxylup – 20(29) – en – 25 – oic…

D§VN III qui ®Þnh ®Þnh tÝnh d−îc liÖu b»ng SKLM vµ dïng acid oleanolic

lµm chÊt ®èi chiÕu.